STR
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
荧光标记的选择
6-FAM = Blue HEX=Green TAMRA=Yellow
LIZ=Orange
荧光PCR
上游引物的5’端作荧Байду номын сангаас标记
PCR反应体系(25μl):
10×PCR缓冲液(含15 mmol/L MgCl2)、1UTaq酶、dNTP各 0.1mmol/L,引物各0.2μmol/L、 模板DNA量约为50ng。 PCR条件: 94 ℃预变性5 min;94℃30 s、合 适的退火温度40 s,72 ℃1 min, 30 个循环;72 ℃延伸5 min。
多重荧光PCR
多重荧光PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以
上的特异引物对,同时扩增多个序列,从而产生高度特异 性的反应过程,该技术能够适应高通量DNA指纹分析的需 要,节省DNA模板和试验耗材,简化操作步骤,加速试验 进程 。
应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠,
极大的提高效率。
微卫星DNA特点
数据大、分布广且均匀 具有极高的个体特异性 多态信息含量高 共显性遗传
微卫星标记的应用
品种鉴定
系谱分析
法医罪犯身份识别及亲子鉴定
群体间遗传距离分析 进化和遗传多样性研究等。
微卫星DNA分子标记技术
通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在 核苷酸排布及其外在形状表现规律的技术。
间、循环数、模板浓度)
毛细管电泳检测
微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后经遗传分析仪毛细管
电泳进行基因组扫描,通过检测片段长度来判断微卫星不 稳定性。
利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析,计 算出微卫星等位变异扩增片段的大小。
• 横坐标代表PCR产物及内标的碱基数 • 纵坐标代表相对荧光信号强度
或者加入液氮研磨),然后离心去上清。
细胞 贴壁细胞应先处理成细胞悬液,然后离心去上清;悬浮细胞则直接离心去上清。
细胞数量为1~5×106 。
血液
基因组DNA的提取 —样本前处理
如果血液(已加入抗凝剂)体积小于200 μl,可以加缓冲液补足200 μl使用; 如果血液体积大于200 μl,则需要在样品中加入三倍体积的红细胞裂解液,混匀 放置5 min,离心去上清; 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级的生物的抗凝血液,其红细胞为有 核细胞,因此处理量为5-20 μl,再加入缓冲液补足200 μl使用。
吸附:将裂解完全的裂解液加入吸附柱内 洗涤:缓冲液漂洗 洗脱:DNA洗脱收集
基因组DNA提取注意事项
样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提 取量也下降。
若要提取出完整度较高的基因组DNA,应尽量减少由于外力
剪切作用对基因组DNA造成的损伤。
提取过程中要小心操作,避免剧烈振荡或使用振荡器。
微卫星DNA分子 标记技术
微卫星DNA
微卫星DNA又称短串联重复序列(STR) 、简单重复 序列(SSR),指DNA基因组中小于10个核苷酸的简 单重复序列,广泛存在于真核基因组中,多数以 2~6个碱基为核心单位、串联重复排列的序列。
微卫星序列类型
单一型:ATATATATATATATATATATATAT 复合型: ATATATCACACACACACACAC 间断型: ATATATCAATATATCAATATATA
基因组DNA的提取 —样本前处理
植物组织
新鲜的植物组织100 mg或干重30 mg,剪碎之后加入液氮充分研磨。注:提取样 品一般选用代谢产物少、细胞数量相对较多的植物组织如健康嫩叶、幼芽等。通
常情况下,在采集前将目标植物置于暗处1-2天,可有效地减少代谢物的产生。
动物组织 动物组织(脾组织用量应少于10 mg)应事先打碎处理成细胞悬液(匀浆器匀浆
STR位点确定-Genbank搜索序列
STR位点确定-SSRHunter1.3软件
引物设计
根据SSR两侧的保守序列设计引物
将SSR序列作为为靶序列,利用软件Primer Premier5.0设
计SSR引物,引物设计的主要参数是:引物长度一般为
18~24bp;理论退火温度Tm值55℃~65℃;(G+C)含量 40% ~70%;PCR扩增产物150bp~350bp之间。
原理
根据微卫星DNA两端序列的保守性,设计一对特 异性的引物,利用PCR技术扩增每个位点的微卫
星DNA序列,以检测分析微卫星序列的多态性,
从而进行相关的遗传学分析。
实验流程
1、基因组DNA的提取 2、确定STR位点,设计引物
3、荧光标记的选择
4、荧光PCR 5、毛细管电泳检测 6、分析数据
细菌 取1-5 ml细菌培养液离心去上清。注:对于较难破壁的革兰氏阳性菌,需要加入 溶菌酶处理。
酵母菌 取酵母细胞(不超过5×107细胞),离心去上清;再用酶解法去除酵母细胞壁。
基因组DNA的提取流程 -根据试剂盒说明书提取
裂解:裂解液+蛋白酶K,对于一些动物组织需要放在
56 ℃条件下裂解
多重荧光PCR前提条件
所有引物对的退火温度必须接近; 在同一反应体系中,所有引物对之间不能有相互作用(形
成引物寡聚体);
同色引物扩增产物应长度有别,这样才可同时对多个位点 进行片段分析。
多重荧光PCR条件优化
引物比例优化(使用同一荧光标记的引物进行优化;所有引 物进行优化)
复合PCR参数优化(dNTP浓度、延长时间、退火温度和时