组织化学技术5免疫组化

Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
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应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
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包埋后染色：
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组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
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成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
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液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
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新配）
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自来水洗净。
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用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
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核（可不染）。
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常规脱水、透明、封固、镜检。
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结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
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（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
卡通风学期汇报
发展简史
辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP
测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
蛋白标记Ab技术。
）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
—— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁
—— 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立
——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检
原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀 度冻存。 ③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释 十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃） 于 冰箱备用。 ④ 关于Ab保存应参照说明书。 （3）Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。
应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。
染色方法
直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上） 荧光显微镜下观察→检测抗原。 酶标抗体要显示后镜检。
（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是： ① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。 ② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确， 洗涤不彻底。 ③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。 ④ 抗体温育的时间过长。 ⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太 厚。
一、免疫组织化学技术
直接法优点：简单，时间短，特异性强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用了！！
间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。
3．非标记Ab桥法： “桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体， 其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法
除上述对照结果分析之外，还必须从以下几
个方面综合评价：
1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构 性。（非特异性～细胞与组织无区别） ② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染 色 弥散性均匀） 2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体 时勿干片。 3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。
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合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各
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个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基
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本技术之一。
免疫组织化学的技术分类 根据染色方式分成：① 贴片染色 漂浮染色 根据Ag—Ab结合方式分成： 直接法 间接法 多层法
（3）按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） 3．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。
ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。
ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理
6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase） 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白 素与链霉（而非生物素）结合，而后再结 合PO 。 它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。
③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。 2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液） （1）工作液：无须稀释 （2）原液： ① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。 如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500 1∶1000，1∶1500试验； 若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍 浅，可选1∶750进行试验。
1MPBS，洗三次，每次5分钟。
1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。
滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。
滴加第二抗体，室温15′~ 60′。
滴加ABC复合物，室温15~60分钟。 0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。
0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。
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DAB—H2O2 显色：用0.01％H2O2的DAB溶
温度与时间 4℃：过液， ＞16 37℃：1 h or 参考说明书 光镜控制显色方法 室内操作：注意温度与时间的关系，室温 最宜5分钟。 染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。 对照组和染色结果的评价
免疫组化染色实验组与对照组结果分析表
从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验or换用Ab。
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—— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）
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法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、
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免疫电镜技术相继问世。
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—— 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细
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胞化学分类方法迅速发展。
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——2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组
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化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综
现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑，原理保密。
蛋白A—金法（Protein—A gold method） ~多用于电镜
双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切 片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不 同的抗原。
免疫金—银染色法 （Immunogold—silver staining IGSS） 固定——见前述 注意事项： 固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和 性能。 固定方式的选择：① 浸渍固定（参考文献） 灌注固定（+后固定） 蒸汽固定
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未加酶消化处理切片。
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2018
切片或涂片过厚。
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2019
漂洗不够。
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2020
底物呈色反应过久。
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2021
蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
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2022
使用全血清抗体稀释不够。
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所有切片背景过深，原因可能是：
阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴
最常见的原因是：标本的固定和处理不当。
前言：
性反应。
免疫电镜技术
免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术
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免疫细胞化学技术——细胞水平（光镜分辨率） 电镜免疫细胞化学技术——超微结构水平 （电镜分辨率） 组织固定与取材 要求：即要求保持良好的超微结构 ，又要求保 持组织的Ag性，固定的选择不宜过强。 常用：1． 4％多聚甲醛 + 1％戊二醛 过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛液（PLP） 液
该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复 合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。
双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 特别提示：注意动物种属关系 PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法） ~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。
（2）常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rho—damine RB200） ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护 难一般不用）
阳性对照：
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进
行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结
果，标为阳性对照。
阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈
阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性
对照中的一种，阴性对照还应包括空白、
替代、吸收和抑制实验。
染色失败的几种原因： 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能： 染色未完全严格按照操作步骤进行； 漏加一种抗体，或抗体失效； 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性； 底物中所加H2O2 量少或失效； 复染或脱水剂使用不当
免疫组化染色步骤（以ABC法为例） 切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。 封闭内源性过氧化物酶。 用新配置的0.3％H2O2 （在PAS或0.05Tris— HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 分 钟。 水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。 减少非特异性着色
用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物 血清！），室温，30分钟。
包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微
01பைடு நூலகம்
镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小
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块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱
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水、包埋。
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优点： ① 抗原不易被破坏，易于获得良好的免
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疫反应。
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可在免疫反应阳性部位定位做超薄
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切片，检出率↑。
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免疫染色
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缺点：经过一系列染色步骤，易损伤结构。