丹黄散纳米银海绵抑制铜绿假单胞菌的效果

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
文章编号:2095-4344(2019)22-03495-05 3495
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·研究原著·
李桃，女，1989年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州中医药大学(原贵阳中医学院)在读硕士，主要从事中西医结合糖尿病护理方面的研究。

通讯作者：张春玲，主任护师，硕士生导师，贵州中医药大学(原贵阳中医学院)第二附属医院，贵州省贵阳市 550003
文献标识码:A
稿件接受：2019-03-29
Li Tao, Master candidate, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine (formerly Guiyang College of Traditional Chinese Medicine), Guiyang 550002, Guizhou Province, China
Corresponding author: Zhang Chunling, Chief nurse, Master’s supervisor, Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine (formerly Guiyang College of Traditional Chinese Medicine), Guiyang 550003, Guizhou Province, China
丹黄散-纳米银海绵抑制铜绿假单胞菌的效果
李 桃1，张春玲2，龙 毅2，邸铁涛2，陈 露2，赵 伟2，龙 丽1，黄 蔷1，唐丽莎1，罗开中1 (1贵州中医药大学(原贵阳中医学院)，
贵州省贵阳市 550002；2贵州中医药大学(原贵阳中医学院)第二附属医院，贵州省贵阳市 550003) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1276 ORCID: 0000-0001-9854-656X(李桃)
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文题释义：
丹银海绵：是将丹黄散与纳米银材料进行有机结合而成，使其不仅具有丹黄散镇痛、活血、除痹、生肌等促糖尿足溃疡愈合之功效，还具有纳米银对铜绿假单胞菌的良好抑菌作用，且不产生耐药性，可直接外敷于溃疡面，为临床治疗糖尿病足溃疡提供了新的思路与方法。

铜绿假单胞菌：是糖尿病足溃疡感染的常见革兰阴性杆菌，有研究显示发生铜绿假单胞菌感染的糖尿病足溃疡愈合率较未感染者愈合率明显降低，且铜绿假单胞菌的耐药性呈逐年上升趋势，因此为临床治疗铜绿假单胞菌感染的糖尿病足溃疡提供一种疗效佳且不产生耐药性的治疗方法显得尤为重要。

摘要 背景：课题组前期研究发现丹黄散可促进糖尿病足溃疡的愈合，但抑菌性能较差，因此将具有广谱抗菌作
用的纳米银与丹黄散有机结合制成了丹黄散-纳米银海绵(以下简称丹银海绵)。

目的：观察丹银海绵对铜绿假单胞菌的抑制效果。

方法：将含纳米银高、中、低浓度(分别含硝酸银22.22%，16.67%，11.11%)的丹银海绵及高、中、低浓度(分别含硝酸银22.22%，16.67%，11.11%)的纳米银海绵裁剪为直径1 cm 的圆形规格，均匀分置于涂
满铜绿假单胞菌悬液的培养基上；用同规格纸片蘸取亚胺培南-西司他丁水溶液，置于涂满铜绿假单胞菌悬液培养基上，作为阳性对照组；将壳聚糖海绵裁剪为直径1 cm 的圆形规格，分置于涂满铜绿假单胞菌悬液
的培养基上，作为阴性对照组。

各组均置于35 ℃恒温箱培养24 h ，观察比较各组抑菌圈的大小。

结果与结论：亚胺培南-西司他丁组对铜绿假单胞菌的抑菌效果优于各浓度纳米银海绵组、各浓度丹银海绵
组及壳聚糖海绵组(P < 0.05)；各浓度纳米银海绵组和各浓度丹银海绵组的抑菌效果优于壳聚糖海绵组
(P < 0.05)；相同硝酸银浓度下，纳米银海绵组和丹银海绵组具有同等的抑菌效果(P > 0.05)；不同浓度的纳米银海绵组抑菌效果无差异(P > 0.05)；不同浓度的丹银海绵组抑菌效果无差异(P > 0.05)；表明丹银海绵对铜绿假单胞菌具有抑制效果，在糖尿病足溃疡治疗中具有独特的优势。

关键词：
丹黄散-纳米银海绵；丹银海绵；纳米银海绵；亚胺培南-西司他丁；壳聚糖海绵；纳米银；铜绿假单胞菌；抑菌效果；糖尿病足溃疡
中图分类号：R459.9；R318.08 基金资助：
2017年度贵州省教育厅自然科学基金重大群体创新课题(黔教合KY 字[2017]042)，项目负责人：张春玲
Inhibitory effects of nanosilver sponge with Danhuang powder on Pseudomonas aeruginosa
Li Tao 1, Zhang Chunling 2, Long Yi 2, Di Tietao 2, Chen Lu 2, Zhao Wei 2, Long Li 1, Huang Qiang 1, Tang Lisha 1, Luo Kaizhong 1 (1Guizhou University of Traditional Chinese Medicine (formerly Guiyang College of Traditional Chinese Medicine), Guiyang 550002, Guizhou Province, China; 2Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine (formerly Guiyang College of Traditional Chinese Medicine), Guiyang 550003, Guizhou Province, China)
李桃，张春玲，龙毅，邸铁涛，陈露，赵伟，龙丽，黄蔷，唐丽莎，罗开中. 丹黄散-纳米银海绵抑制铜绿假单胞菌的效果[J]. 中国组织工程研究，2019，23(22):3495-3499. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1276
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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Abstract
BACKGROUND: Danhuang powder has been recently shown to promote the healing of diabetic foot ulcers, but its antibacterial activity is not satisfactory. Therefore, broad-spectrum antibacterial nanosilver sponge is loaded with Danhuang powder for clinical application.
OBJECTIVE: To investigate the antibacterial activity of nanosilver sponge with Danhuang powder against Pseudomonas aeruginosa .
METHODS: Nanosilver sponge with Danhuang powder containing 22.22%, 16.67%, 11.11% silver nitrate (Danhuang-nanosilver group) and simple nanosilver sponge containing 22.22%, 16.67%, 11.11% silver nitrate (simple nanosilver group) were cut into round pieces (1 cm in diameter) and placed on Pseudomonas aeruginosa suspension-spread culture medium. Paper sheets of the same size were dipped in the imipenem-cilastatin aqueous solution (imipenem-cilastatin group) and then also positioned on Pseudomonas aeruginosa suspension-spread culture medium for positive controls. For negative controls, chitosan sponge of the same size was used (chitosan group). All tested materials were cultured in an incubator at 35 °C for 24 hours, and the size of the inhibition zone was compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa in the imipenem-cilastatin group was superior to that in the Danhuang -nanosilver, simple nanosilver, chitosan groups (P < 0.05). The antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa in the Danhuang -nanosilver and simple nanosilver groups was superior to those in the chitosan group (P < 0.05). The antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa was similar between Danhuang -nanosilver and simple nanosilver groups at the same concentration of silver nitrate (P > 0.05). There was no significant difference in the antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa between different concentrations of silver nitrate in the simple nanosilver and Danhuang -nanosilver groups (both P > 0.05). These results suggest that
nanosilver sponge with Danhuang powder exhibits antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa , showing unique advantages in the treatment of diabetic foot ulcers.
Key words: nanosilver sponge with Danhuang powder; Danhuang -nanosilver sponge; nanosilver sponge; imipenem-cilastatin; chitosan sponge; nanosilver; Pseudomonas aeruginosa ; antibacterial effects; diabetic foot ulcers
Funding: The Natural Science Foundation of Guizhou Provincial Department of Education for Major Group Innovation Project in 2017, No. qianjiaohe-KY-[2017]042 (to ZCL)
0 引言 Introduction
糖尿病足溃疡一直是临床治疗的难题，并日渐成为严重的社会问题[1]。

铜绿假单胞菌是糖尿病足溃疡感染的主要致病菌种之一，有研究显示发生铜绿假单胞菌感染的糖尿病足溃疡愈合率较未感染者愈合率明显降低[2-4]。

亚胺培南-西司他丁是治疗铜绿假单胞菌的有效药物，然而近年来随着碳青霉烯类抗菌药物临床使用越来越普遍，铜绿假单胞菌对亚胺培南-西司他丁的耐药率呈逐年升高趋势，加大了临床治疗难度
[5-6]。

课题组前期研究发现丹黄散对糖尿病足溃疡有较好
的促愈作用，但抑菌性能较差。

因此，课题组将具有广谱抗菌作用的纳米银与丹黄散有机结合，制成丹黄散-纳米银海绵(以下简称丹银海绵)，并通过体外抑菌实验研究其对铜绿假单胞菌的抑菌效果，以期在促愈糖尿病足溃疡的基础上增加其抑菌性能，且不产生耐药性，提高治疗效果。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 对比观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年11至12月在贵州中医药大学(原贵阳中医学院)进行。

1.3 材料 高、中、低浓度(含硝酸银2
2.22%，16.67%，11.11%)纳米银海绵，高、中、低浓度(含硝酸银22.22%，16.67%，11.11%)的丹银海绵，壳聚糖海绵，见表1；铜绿假单胞菌(美国ATCC)；TSB 培养基、纯化琼脂粉(北京陆桥)；细菌培养皿(15 cm ，NEST)；亚胺培南-西司他丁(杭州默沙东制药有限公司)。

1.4 实验方法
1.4.1 菌悬液的制备 称取胰蛋白胨3 g 及1.5 g 纯化琼脂粉，溶于100 mL 超纯水中，经高压蒸汽灭菌后分装至 6 cm 细菌培养皿，待其冷却凝固后，采用平板划线法将铜绿假单胞菌接种于培养基，置于35 ℃恒温箱培养24 h ；将3 g 胰蛋白胨溶于100 mL 超纯水中，经高压蒸汽灭菌后分
装于无菌试管，作为细菌培养液备用，待细菌培养液冷却至35 ℃，将前期培养的铜绿假单胞菌菌落接种于培养液中，置于35 ℃恒温箱培养24 h ，制得铜绿假单胞菌菌悬液。

1.4.2 丹银海绵的抑菌性能检测 称取3 g 胰蛋白胨及 1.5 g 纯化琼脂粉，溶于100 mL 超纯水中，经高压蒸汽灭菌后分装于15 cm 细菌培养皿，待其完全冷却凝固为固体培养基后备用；用无菌棉球蘸取前期制备之铜绿假单胞菌菌悬液，将其涂满固体培养基表面，将高、中、低浓度的丹银海绵及纳米银海绵裁剪为直径1 cm 圆形规格，均匀分置于培养基上；无菌滤纸裁剪同规格纸片，蘸取亚胺培南-
西司他丁水溶液，也置于培养基上，作为阳性对照组；同时将前期准备的壳聚糖海绵裁剪为直径1 cm 圆形规格，分置于培养基上，作为阴性对照组。

将制备好的培养基置于
表
1 自制海绵材料理化性能介绍 Table 1 Physical and chemical properties of self-made sponge 项目
丹银海绵 纳米银海绵 壳聚糖海绵 来源
自制 自制 自制 主要组成成分 丹黄散、银纳米、壳聚糖 银纳米、壳聚糖
壳聚糖 外形
疏松多孔
疏松多孔
疏松多孔
制备方法
将浓度为2%的羧甲基壳聚糖水溶液与硝酸银水溶液混合，在紫外线灯照射下经磁力搅拌，得到含银纳米粒子的羧甲基壳聚糖水溶液，将其冷冻、干燥得到后纳米银海绵，将丹黄散膏剂负载于纳米银海绵即得丹黄散-纳米银海绵
将浓度为2%的羧甲基壳聚糖水溶液与硝酸银水溶液混合，在紫外线灯照射下经磁力搅拌，得到含银纳米粒子的羧甲基壳聚糖水溶液，将其冷冻、干燥后得到纳米银海绵 将浓度为2%的羧甲基壳聚糖水溶液冷冻、干燥后得到壳聚糖海绵 理化性质
吸液率12.21，保液率6.30，透气率62%
吸液率12.64，保液率 6.05，透气率61%
吸液率13.02，保液率5.79，透气率61% 与人体的生物相容性
尚未应用于人体
尚未应用于人体 尚未应用于人体
不良反应 暂未发现
暂未发现
暂未发现
Li T, Zhang CL, Long Y, Di TT, Chen L, Zhao W, Long L, Huang Q, Tang LS, Luo KZ. Inhibitory effects of nanosilver sponge with Danhuang powder on
Pseudomonas aeruginosa. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(22):3495-3499. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1276
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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35 ℃恒温箱培养24 h 。

1.5 主要观察指标 观察各组抑菌圈的大小，判定不同浓度丹银海绵的抑菌效果。

1.6 统计学分析 使用SPSS 17.0．0统计软件进行统计学分析，计量资料以x _
±s 表示，组间抑菌效果比较采用两配对样本t 检验，组内抑菌效果比较采用方差分析及LSD 检验，均取双侧检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 各组抑菌实验结果 采用IMAGEJ 测算各组抑菌面积，为确保结果的精确度，将亚胺培南-西司他丁组抑菌面积作为基数值，计算出各干预组面积比值，见表2。

2.2 各组之间抑菌效果的比较 亚胺培南-西司他丁组的抑菌效果优于纳米银海绵组，见图1。

亚胺培南-西司他丁组的抑菌效果优于各浓度丹银海绵组(P < 0.05)，见图2。

亚胺培南-西司他丁组的抑菌效果优于壳聚糖海绵组 (P < 0.05)，见图3。

各浓度纳米银海绵组的抑菌效果优于壳聚糖海绵组(P < 0.05)，见图4。

各浓度丹银海绵组的抑菌效果优于壳聚糖海绵组(P < 0.05)，见图5。

相同硝酸银浓度下，纳米银海绵组和丹银海绵组具有同等的抑菌效果(P > 0.05)，见图6。

不同浓度的纳米银海绵抑菌效果无差异(P > 0.05)，见图7。

不同浓度的丹银海绵抑菌效果无差异(P > 0.05)，见图8。

表2 各组抑菌圈面积和面积比值 (x _
±s ) Table 2 Area of inhibition zone and area ratio in each group
组别
面积(µm 2) 面积比值 高浓度纳米银海绵组
219 408±2 433 0.743±0.017 中浓度纳米银海绵组
218 908±1 888 0.741±0.012 低浓度纳米银海绵组 218 446±1 546 0.740±0.014 高浓度丹银海绵组 219 775±935 0.744±0.013 中浓度丹银海绵组
218 794±624 0.741±0.011 低浓度丹银海绵组
218 626±947 0.740±0.012 亚胺培南-西司他丁组 295 330±4 946 1.000±0.000 壳聚糖海绵组
995 50±2 047
0.337±0.011
图1 各浓度纳米银海绵组与亚胺培南-西司他丁组抑菌效果的比较 Figure 1 Comparison of antibacterial activity between nanosilver
and imipenem-cilastatin groups
--
抑菌面积比值
图2 各浓度丹银海绵组与亚胺培南-西司他丁组抑菌效果的比较 Figure 2 Comparison of antibacterial activity between
Danhuang -nanosilver and imipenem-cilastatin groups
--抑菌面积比值
亚胺培南-西司他丁组
丹银海绵组 1.2- 1.0- 0.8- 0.6- 0.4- 0.2- 0- -0.2- -0.4- -0.6- -0.8-
抑菌面积比值
图3 壳聚糖海绵组与亚胺培南-西司他丁组抑菌效果的比较 Figure 3
Comparison of antibacterial effects between chitosan and imipenem-cilastatin groups
亚胺培南-西司他丁组 壳聚糖海绵组
----抑菌面积比值
纳米银海绵组
图4 各浓度纳米银海绵组与壳聚糖海绵组抑菌效果的比较
Figure 4 Comparison of antibacterial activity between nanosilver
and chitosan groups
----抑菌面积比值
图5 各浓度丹银海绵组与壳聚糖海绵组抑菌效果的比较 Figure 5 Comparison of antibacterial activity between Danhuang -nanosilver and chitosan groups
丹银海绵组
李桃，张春玲，龙毅，邸铁涛，陈露，赵伟，龙丽，黄蔷，唐丽莎，罗开中. 丹黄散-纳米银海绵抑制铜绿假单胞菌的效果[J]. 中国组织工程研究，2019，23(22):3495-3499. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1276
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3 讨论 Discussion
糖尿病足溃疡是糖尿病的严重并发症，糖尿病患者一生中发生足部溃疡的风险高达25%[7-8]，是糖尿病低位远端截肢(趾)的首位原因[9]。

国外调查发现糖尿病足溃疡截肢患者5年病死率高达50%-68%，甚至高于大部分癌症患者5年病死率[1
，10]
，如何有效治疗糖尿病足溃疡已成为目前重要的公共
卫生问题之一。

研究表明控制伤口感染可提高糖尿病足溃疡治疗效果，改善其预后[11-12]。

铜绿假单胞菌是糖尿病足溃疡感染常见的革兰阴性杆菌，近年来铜绿假单胞菌对亚胺培南-西司他丁的敏感性呈逐年降低趋势，只有25.84%[13]。

因此，为临床治疗铜绿假单胞菌感染糖尿病足溃疡提供一种疗效佳且不产生耐药性的方法，显得尤为重要。

实验所用丹银海绵由丹黄散和纳米银有机结合而成，其中丹黄散是在中医理论指导下，结合现代药理学研究，由丹参、大黄、当归等六味中药组成的外用散剂，是外敷治疗糖尿病足溃疡的中草药经验方[14]。

中医将糖尿病足溃疡纳入“痈疽”范畴，是因消渴日久、痰湿、热毒内生，气血瘀阻、肢体失于濡养、化肉成腐所致[15]。

纵观丹黄散全方：丹参活血化瘀、去瘀生新，大黄清热利湿、解毒凉血，两者共为君药；当归补血、活血，为臣药；没药推陈致新，活死血，和新血为佐药；沉香行气、止痛，松香燥湿，引经达位，共为使药；诸药合用具有活血化瘀、去腐生肌、镇痛消炎等促糖尿足溃疡愈合的功效[14]。

课题组前期研究证实丹黄散可以下几个方面促进糖尿足溃疡的愈合：①丹黄散可增强成纤维细胞的增殖活性[16]；②增强糖尿病足创面再上皮化能力[17-18]；③促进创面新生毛细血管形成[19]；④丹黄散局部外敷改善了局部循环，抑制了细菌繁殖，重新调节了创面局部浸润细胞和细胞因子的种类及数量，使局部微环境向利于溃疡愈合的方向转化有关[20]；⑤丹黄散外用纠正了糖尿病足溃疡局部分子病理改变基础[14]。

现代药理学研究也证实丹参内的有效成分之一丹参酮，具有抗菌消炎、抗溃疡、促进纤维蛋白原降解等作用，有研究证实丹参酮胶囊在体外对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌作 用[21-23]，但对革兰阴性菌的抑菌性能较差；大黄及其提取物对金葡菌、革兰阳性菌、链球菌、真菌等均有一定的抑制作用，且不产生耐药性[24-26]；当归及其提取物有镇痛、抗炎、抗氧化等作用；沉香有较强的抗菌作用[27-28]；松香有抑菌、排脓拔毒的功效[29]。

综上所述，丹黄散可有效促愈糖尿足溃疡，但对革兰阴性菌的抑菌性能较差。

纳米银是“银纳米颗粒”的俗称，是金属银的一种特殊形态，相比银来说，纳米银作为一类新型抗菌剂，具有更强大的抑菌和杀菌作用，抗菌谱广，无耐药性且其杀菌有效性持久[30-31]。

目前比较公认的纳米银抗菌机制主要有：①纳米银颗粒通过持续释放银离子发挥抗菌作用，游离出的银离子通过破坏细菌细胞膜和阻止细菌DNA 复制发挥杀菌或抑菌作用[32-33]；②纳米银本身的表面效应、量子尺寸效应和小尺寸效应等物理化学特性，可联合发挥抗菌作用[33-34]。

大量研究表明纳米银的生物安全性明显高于同剂量的银离子，长期使用纳米银敷料安全可行，且对革兰阴性菌的抗菌作用强于革兰阳性菌[35-36]。

随着细菌耐药性的不断增加和微纳米技术的发展，纳米银在皮肤疾病治疗中的作用日益受到重视。

实验以亚胺培南-西司他丁为阳性对照，壳聚糖海绵为阴性对照，通过对比观察性实验探讨了丹黄散-纳米银海绵对铜绿假单胞菌的抑菌性能，结果显示亚胺培南-西司他丁对铜绿假单胞菌的抑菌效果优于纳米银海绵、丹银海绵及壳聚糖海绵(P < 0.05)；其中不同浓度纳米银海绵的抑菌效果无差异(P > 0.05)，不同浓度丹银海绵的抑菌效果无差异(P > 0.05)，可能与实验所设立的浓度梯度不够大有关；纳米银海绵和丹银海绵的抑菌效果优于壳聚糖组(阴性对照
抑菌面积比值
1.0-
0.8- 0.6-
0.4-
0.2- 0-
-0.2- -0.4- 图注：相同硝酸银浓度下，纳米银海绵组和丹银海绵组具有同等的抑菌效果(P >0.05)。

图6 各浓度纳米银海绵组和丹银海绵组抑菌效果的比较
Figure 6 Comparison of antibacterial activity between nanosilver group and Danhuang -nanosilver group
1.0-
0.8-
0.6- 0.4-
0.2- 0-
-0.2- -0.4- 抑菌面积比值 图注：不同浓度的纳米银海绵抑菌效果无差异(P > 0.05)。

图7 不同浓度纳米银海绵抑菌效果的比较
Figure 7 Comparison of antibacterial activity between different concentrations of silver nitrate in the nanosilver group
图注：不同浓度的丹银海绵抑菌效果无差异(P > 0.05)。

图8 不同浓度丹银海绵抑菌效果的比较 Figure 8 Comparison of antibacterial activity between different concentrations of silver nitrate in the Danhuang -nanosilver group
--抑菌面积比值
高浓度 中浓度 低浓度
高浓度丹银海绵 中浓度丹银海绵 低浓度丹银海绵
纳米银海绵组 丹银海绵组
Li T, Zhang CL, Long Y, Di TT, Chen L, Zhao W, Long L, Huang Q, Tang LS, Luo KZ. Inhibitory effects of nanosilver sponge with Danhuang powder on
Pseudomonas aeruginosa. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(22):3495-3499. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1276
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组)(P < 0.05)，且含相同硝酸银浓度下，纳米银海绵和丹银海绵对铜绿假单胞菌具有同等的抑菌效果(P > 0.05)，表明将丹黄散与纳米银相结合没有影响纳米银的抗铜绿假单胞菌活性。

实验结果表明，将丹黄散与纳米银材料进行结合制成的丹黄散-纳米银海绵，弥补了丹黄散对铜绿假单胞菌抑菌性能较差的缺陷，使其不仅具有丹黄散镇痛、活血、除痹、生肌等促愈糖尿足溃疡之功效，还有纳米银对铜绿假单胞菌的良好抑菌作用，且不产生耐药性，为临床治疗糖尿病足溃疡提供了新的思路与方法。

但实验仅研究了丹黄散-纳米银海绵对铜绿假单胞菌这一种革兰阴性菌的抑菌性能，尚未对糖尿足溃疡感染的其他致病菌进行系统研究，且由于实验所设立的浓度梯度较小，尚未明确何种浓度的丹黄散-纳米银海绵抑菌效果最优，将在下一步的研究中进行完善，以期为丹黄散-纳米银海绵未来在糖尿足溃疡中的应用提供更加完整的科学依据。

作者贡献：张春玲、邸铁涛、龙毅、赵伟进行实验设计，实验实施为龙毅、龙丽、黄蔷、李桃、陈露。

实验评估为张春玲、龙毅。

资料收集为龙丽，唐丽莎，罗开中。

李桃、张春玲成文，李桃、张春玲审校。

经费支持：该文章接受了“2017年度贵州省教育厅自然科学基金重大群体创新课题(黔教合KY 字[2017]042)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程不存在利益冲突。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：该文统计学方法已经经贵州中医药大学(原贵阳中医学院)生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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