狼毒科技论文

狼毒大戟化学成分研究
Studies on Chemical Components of Euphorbia Fischeriana
作者姓名：许鑫郭岩龙鑫
学院、专业：化工学院制药工程
齐齐哈尔大学
Qiqihar Universit
狼毒大戟化学成分研究
【摘要】大庆林甸产的新鲜狼毒大戟地上部分用95%乙醇浸泡、过滤、浓缩后，分别用正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，各种提取物分别占新鲜狼毒大戟地上部分重量的0.8%、0.6%、0.2%和0.6%。

取15.2 g正己烷层提取物经硅胶色谱柱和高效液相 (反相)分离，得到四种含量较大的单体化合物。

结合文献，经核磁共振谱等鉴定结构分别为： 3-乙酰氧基-5,12-齐墩果二稀、3-羟基-5,12-齐墩果二稀、12-去氧佛波醇-13六酸酯、12-去氧佛波醇-13-十六酸酯-4-烯。

【关键词】狼毒大戟；3-乙酰氧基-5,12-齐墩果二稀；3-羟基-5,12-齐墩果二稀；12-去氧佛波醇-13-十六酸酯；12-去氧佛波醇-13-十六酸酯-4-烯
Studies on Chemical Components of Euphorbia
Fischeriana
【Abstract】The fresh aerial parts of Euphorbia fischeriana taken from Lindian of Daqing were soaked in 95% ethanol, filtered and concentrated, extracted the solution with n-hexane, EtOAc, CDCl3, n-butanol. Which constituted about 0.8%, 0.6%, 0.2% and 0.6%.The extraction of n-hexane (15.2 g) were isolated by silica column chromatography and HPLC(ODS), and obtain four compounds. The chemical structures of these compounds were determined by spectra of 1H NMR, is show that they were 3β-acetoxyolean-5,12-dien;3β-hydroxyolean-5,12-dien;12-deoxyphorbol-
13-hexadec-anoate; 12-deoxyphorbol-13-hexad ecanoate-4-alkene.
【Keywords】Euphorbia fischeriana; 3β-acetoxyolean-5,12-dien; 3β-hydroxyolean-5,12-dien;
12-deoxyphorbol-13-hexadecanoate; 12-deoxyphorbol-13-hexadecanoate-4-alkene
目录
摘要 (I)
Abstract ...................................................... I I
1 引言 (1)
2 化学部分 (2)
3 实验部分 (2)
3.1 仪器与材料 (2)
3.2 提取与分离 (2)
3.3 结构鉴定 (4)
结论 (8)
参考文献 (9)
附录 (10)
1 引言
目前艾滋病已不是单纯的医学问题，已成为一个严重的社会问题，被称为人类的“世纪瘟疫”。

据联合国艾滋病规划署最新的一份报告显示，截至2007年12月，全球有3320万人携带艾滋病毒，并有210万人死于艾滋病，中国约有70万人感染了艾滋病。

1996年美裔华人科学家何大一发明的“鸡尾酒疗法”（高效抗逆转录病毒治疗法，HAART），为目前掌握的最有效的抗艾滋病方法。

鸡尾酒疗法可以成功地降低患者血浆中艾滋病病毒的水平，使艾滋病病毒达到不被检测到的程度。

然而，总有少量病毒隐藏在免疫系统的T细胞中，治疗药物不能处理这些潜伏的病毒，因此当治疗中断时经常出现病毒的反弹，这也是艾滋病无法根治的最大障碍。

研究发现，12-脱氧巴豆烷型二萜化合物 Prostratin 与鸡尾酒疗法联合使用有望根治艾滋病。

Prostratin有两种功效，首先，它能促使体细胞减少分泌艾滋病病毒受体，使艾滋病感染率下降；其次，它可以逼出隐藏在免疫细胞内的艾滋病病毒，再使用鸡尾酒疗法中的各种抗艾滋病药物，人类就有可能最终根治艾滋病。

Prostatin主要存在于南太平洋岛国萨摩亚（Samoa）群岛的雨林树木Homalanthus nutans中，但获得提取物的植物来源非常有限（占树枝重量的0.00052 %），而且分离出纯净单体也很困难。

虽然已经开始着手通过微生物工程技术解决供给问题，但目前尚无满意的结果。

2008年美国斯坦福大学的 Paul A．Wender 等人利用巴豆种子提取植物油中佛波醇为原料，通过化学合成的方法实现了 Prostratin 的人工合成（Science, Vol 320, 649, 2008），但合成方法的优化与合成产率 (7 %) 的提高有待进一步研究。

因此，Prostratin的来源仍然是一个急待解决的重要问题。

本课题瞄准当今艾滋病治疗最迫切的问题，以我省及周边地区资源丰富的狼毒大戟为原料，分离、合成Prostratin，解决其来源问题，给几千万艾滋病患者带来福音。

本课题通过对新鲜狼毒大戟地上下部分化学成分的分离，获取抗肿瘤、抗癌活性的二萜和三萜类化合物。

不仅为开发新型艾滋病治疗药物提供原料，也为将来Prostratin的大量制备提供一种可行的方法，研究产品和制备技术都具有广阔的市场应用。

2化学成分
狼毒大戟的化学成分主要包括二萜和三萜类化合物，还有黄酮，鞣质类，甾醇类，蒽醌，挥发油成分等。

3 实验部分
3.1 仪器与材料
仪器：Bruker AU-400型核磁共振波谱仪； ZF-20C暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；高压液相色谱仪；层析用硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）；薄层层析板（烟台汇友硅胶
开发有限公司）。

材料：2009年5月29日于大庆市林甸县红旗镇采得新鲜狼毒大戟。

经齐齐哈尔大学生物系沙伟教授鉴定为Euphorbiae fischerianae Steud.
3.2 提取与分离
将新鲜的狼毒大戟地上部分4 kg，剪碎后，用95%乙醇冷浸提取5次，每次用无水乙醇7 L浸泡。

乙醇提取液过滤后合并、减压浓缩得到浓缩液并加入水混悬后，依次用正己烷(3 × 1000 mL)，乙酸乙酯(3 × 1000 mL)，正丁醇(3 × 1000 mL) 萃取。

将各萃取液浓缩至重量不再变化，得到正己烷提取物90.5 g，乙酸乙酯提取物63.0 g，正丁醇提取物59.0 g。

取上述正己烷层提取物15.2 g，进行柱层析，依次用石油醚/乙酸乙酯 = 7 / 3 (3200 mL) 石油醚/乙酸乙酯 = 3 / 7 (2000 mL) 乙酸乙酯 (1500 mL) 洗脱，用薄层色谱检测，合并相同流分，得到十个部分 (EH-1～EH-10)；将其中第三部分（EH-3，4.0 g）进行柱层析，依次用石油醚 / 乙酸乙酯 = 95 / 5 (3800 mL) 石油醚 / 乙酸乙酯 = 7 / 3 (1700 mL) 乙酸乙酯 (1500 mL) 洗脱，用薄层色谱检测，合并相同流分，得到十个部分 (EH-3-1~EH-3-10)；将其中第三部分（EH-3-3 ，76.4 mg）进行高效液相 (反相)分离制得化合物1；将其中第八部分（EH-3-8 ，30.3 mg）进行高效液相 (反相)分离制得化合物2。

将第六部分（EH-6，125.8 mg)进行柱层析，依次用石油醚 / 乙酸乙酯 = 7 / 3 (1400 mL) 石油醚/乙酸乙酯 = 4 / 6 (300 mL) 乙酸乙酯 (500 mL) 乙酸乙酯 / 甲醇 = 5 / 5 (300 mL) 洗脱，用薄层色谱检测，合并相同流分，得到六个部分 (EH-6-1~EH-6-6)。

将其中第五部分（EH-6-5，23.2 mg) 进行柱层析，依次用石油醚 / 乙酸乙酯 = 7 / 3 (300 mL) 乙酸乙酯 (100 mL) 洗脱，用薄层色谱检测，合并相同流分，分离制得化合物3和分离制得化合物4。

狼毒大戟地上部分正己烷层（EH）
Silica gel290.0g
Sample15.2g
H/E=7/3 3.2L
H/E=3/72.0L
E 1.5L
EH-1 8.4mg EH-2
1.2g
EH-3EH-4
1.1g
EH-5
266.4mg137.4mg
EH-7
354.0mg
EH-8
226.3mg
EH-9
109.4mg
EH-10
2.2g
Silica gel245.0g
4.0g
H/E=95/5 3.8L
H/E=7/3 1.7L
E 1.5L
EH-3-1 272.5mg EH-3-2
343.5mg
EH-3-3
76.4mg
EH-3-4
104.8mg
EH-3-5
51.9mg
EH-3-6
194.6mg
EH-3-7
364.5mg
EH-3-8
1.7g
EH-3-9
401.1mg
EH-3-10
1.3g
HPLC
EH-3-3-1
5.7mg
8.9mg EH-3-3-3
5.0mg
EH-3-3-4
12.8mg
1
Sample30.3mg
M/W=98/2
EH-3-8-1
3.6mg
EH-3-8-2
0.5mg
EH-3-8-4
0.3mg
EH-3-8-5
1.8mg
EH-3-8-6
1.6mg
EH-3-8-7
4.4mg
2
0.5mg
Silica gel45.0g
H/E=7/3 1.4L
H/E=4/6300mL
E500mL
E/M=5/5300mL
EH-6-1~3
37.3mg
EH-6-5
23.2mg
EH-6-6
27.2mg
Silica gel 6.0g
H/E=7/3300mL
E100mL
EH-6-5-1
3.1mg
EH-6-5-3
11.6mg
EH-6-5-5
4.1mg
4
3.8mg
3
2.0mg
HPLC
(D=5.3cm)
柱层析(D=5.0cm)
柱层析(D=2.8cm)
柱层析(D=1.3cm)
图1狼毒大戟地上部分正己烷层分离流程图
M
3.3 结构鉴定
化合物1: 无色针状晶体。

TLC检测，展开剂为V (石油醚) / V (乙酸乙酯) = 9 / 1，呈单一斑点，用w (H2SO4) = 5％的稀硫酸处理成紫色。

1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ0.89 (3H, s, 23, 24-CH3), 0.98 (3H, s, 25, 26-CH3, J = 2.5 Hz), 1.15 (3H, s, 27-CH3), 0.77 (3H, s, 28-CH3), 0.83 (3H, s, 29, 30-CH3)是8个单峰甲基的吸收信号。

δ2.05 (3H, s, CH3CO), 4.52 (1H, t, J = 10.3 Hz, 3-H), 5.24 (1H, d, J = 3.7 Hz, 6-H), 5.09 (1H, d, J = 3.5 Hz,12-H)。

以上光谱学数据与文献[47]一致，故确定该化合物为三萜类化合物3-乙酰氧基-5,12-齐墩果二稀。

化合物2:无色针状晶体。

TLC检测，展开剂为V (石油醚) / V (乙酸乙酯) = 7 / 3，呈单一斑点。

1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ0.89 (3H, S, 23, 24-CH3), 0.98 (3H, s, J= 2.5 Hz, 25, 26-CH3),
1.15 (3H,s, 27-CH3), 0.85 (3H,S, 28-CH3), 0.89 (3H,S, 29, 30-CH3)出现了8个单峰甲基的吸收信号。

δ1.50 (1H,S, OH), 3.48 (1H, t, J = 11.1 Hz,3-H), δ5.25 (1H, d, J = 3.7 Hz, 6-H), 5.12(1H, d, J = 3.5 Hz, 12-H)。

以上光谱学数据与化合物1对照，3号位置是醇羟基，其余一致，故确定该化合物为三萜类化合物3-羟基-5,12-齐墩果二稀。

化合物3: 淡黄色晶体。

1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ1.19 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.97 (3H, s 显示3个单峰甲基的吸收信号。

在0.88 (3H, d，J = 6.4 Hz)处显示一个双峰甲基的吸收信号，在δ4.04 (1H, d, J = 12.8 Hz), 3,98 (1H, d, J = 12.8 Hz) 和2.46 (1H, d, J = 19.2 Hz), 2.52 (1H, d, J = 19.2 Hz) 还给出了两个带有不等价质子的亚甲基。

在δ0.85 (3H, m) 处为饱和直链脂肪烃末端甲基质子吸收信号，在δ2.29 (24H, t, J = 6.4 Hz) 处给出与不饱和碳相连的亚甲基吸收信号，根据以上结果，结合文献初步判断可能存在大戟烷型二萜的骨架结构。

此外，在高场还存在饱和长链烷烃的亚甲基信号δ 1.26 (24H, br s)。

以上数据与文献[19]一致，因此鉴定为12-deoxyphorbol-13-hexadecanoate。

化合物4:淡黄色晶体。

1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ1.19 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.97 (3H, s) 显示3个单峰甲基的吸收信号。

在0.86 (3H, d) 处显示一个双峰甲基的吸收信号，在δ4.23 (1H, d, J = 11.2 Hz), 4.12 (1H, d, J = 11.2 Hz) 还给出了两个带有不等价质子的亚甲基。

在δ0.85 (3H, m) 处为饱和直链脂肪烃末端甲基质子吸收信号，在δ2.31 (24H, t, J = 6.4 Hz) 处给出与不饱和碳相连的亚甲基吸收信号，根据以上结果，结合文献初步判断可能存在大戟烷型二萜的骨架结构。

此外，在高场还存在饱和长链烷烃的亚甲基信号δ1.26 (24H, br s) 。

以上数据与化合物3对照，5号位置是双键，其余一致，因此鉴定为12-去氧佛波醇-13-十六酸酯-4-烯。

化合物1化合物2
2)14CH3 O
2
2)14CH3 O
2
化合物3化合物4
表3-1 化合物1和2的核磁共振氢谱数据（CDCl3）
position 1 2
1 1.26 (2H, m) 1.29 (2H, m)
2 1.60 (2H, m) 1.61 (2H, m)
3 4.52 (1H, t, J = 10.3 Hz) 3.48 (1H, t, J = 11.1 Hz)
6 5.24 (1H, d, J = 3.
7 Hz) 5.25 (1H, d, J = 3.7 Hz)
7 1.68 (2H, d, J = 7.79 Hz) 1.61 (2H, d, J = 6.67 Hz)
9 1.99 (1H, t, J = 8.4 Hz) 1.69 (1H, t, J = 6.6 Hz)
11 1.95 (2H, m) 1.94 (2H, m)
12 5.09 (1H, d, J = 3.5 Hz) 5.12 (1H, d, J = 3.5 Hz)
15 1.26 (2H, m) 1.28 (2H, m)
16 1.22 (2H, m) 1.25 (2H, m)
18 1.89 (1H, m) 1.89 (1H, m)
19 1.10 (2H, m) 1.10 (2H, m)
21 1.66 (2H, m) 1.66 (2H, m)
22 1.43 (2H, m) 1.43 (2H, m)
23,24 0.89 (6H, s) 0.89 (6H, s)
25,26 0.98 (6H, d, J = 2.5 Hz) 0.98 (6H, d, J = 2.5 Hz)
27 1.15 (3H, s) 1.15 (3H, s)
28 0.77 (3H, s) 0.85 (3H, s)
29,30 0.83 (6H, s) 0.89 (6H, s)
CH3CO 2.05 (3H, s)
-OH 1.50 (1H, s)
表3-2 化合物3和4的核磁共振氢谱数据（CDCl3）
Position 3 4
1 7.59 (1H, br s) 7.59 (1H, br s)
5 a) 2.4
6 (1H, d, J = 19.2 Hz) 7.2
7 (1H, s)
b) 2.52 (1H, d, J = 19.2 Hz)
7 5.68 (1H, d, J = 5.2 Hz) 5.68 (1H, d, J = 5.2 Hz)
8 3.00 (1H, m) 3.00 (1H, m)
10 3.27 (1H, br s) 3.27 (1H, br s)
11 1.97 (1H, m) 1.97 (1H, m)
12 a) 1.58 (1H, d, J = 6.8 Hz) a) 1.58 (1H, d, J = 6.8 Hz)
b) 2.06 (1H, dd, J = 6.8,15.0 Hz) b) 2.06 (1H, dd, J = 6.8, 15.0 Hz)
14 0.82 (1H, d, J = 2.8 Hz) 0.82 (1H, d, J = 2.8 Hz)
16 1.19 (3H, s) 1.19 (3H, s)
17 1.07 (3H, s) 1.07 (3H, s)
18 0.88 (3H, d, J = 6.4 Hz) 0.88 (3H, d, J = 6.4 Hz)
19 1.77 (3H, s) 1.77 (3H, s)
20 a) 4.04 (1H, d, J = 12.8 Hz) a) 4.23 (1H, d, J = 11.2 Hz)
b) 3.98 (1H, d, J = 12.8 Hz) b) 4.12 (1H, d, J = 11.2 Hz) COCH2(CH2)CH2CH30.85 (3H, m) 0.85 (3H, m)
COCH2(CH2)CH2CH3 2.29 (2H, t, J = 6.4 Hz) 2.31 (2H, t, J = 6.4 Hz)
COCH2(CH2)CH2CH3 1.26 (24H, br s) 1.26 (24H, br s)
结论
本文采用柱层析、高效液相方法对狼毒大戟地上部分的化学成分进行提取，然后再进行进一步细分及纯化，最后对所得的单体化合物进行核磁共振氢谱分析并与文献对照，最终确定其结构。

得到主要结论如下：对狼毒大戟地上部分采取先萃取得不同极性提取物，再对其正己烷提取物进行柱层析分离的方法是可行的；采用多次硅胶柱层析并结合高效液相方法，从狼毒大戟地上部分的正己烷层萃取物中分离鉴定了4个单体化合物，通过核磁共振谱并与文献对照鉴定为：3-乙酰氧基-5,12-齐墩果二稀、3-羟基-5,12-齐墩果二稀、12-去氧佛波醇-13-十六酸酯、12-去氧佛波醇-13-十六酸酯-4-烯；化合物1、2、3、4分别占乙酸乙酯提取物重量0.06 %，0.18 %，0.13 %，0.15 %。

参考文献
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[8] 刘桂芳. 中华全国中医学会中药学会首届学术会议资料[M]. 人民军医出版社，1987:878.
附录
附录1：
主要符号表
Symbols
Construe of symbols or abbreviations 缩略语的解释or abbreviations
δchemical shift (in NMR) 化学位移
Ac Acetyl 乙酰基
cm centimeter (s) 厘米
d doublet (in spectral) 双峰
Et Ethyl 乙基
g gram (s) 克
Hz Hertz 赫兹
IR Infrared 红外
J coupling constant (in NMR) 偶合常数
L liter (s) 升
MHz Megahertz 兆赫兹
min minute (s) 分
m.p. meting point 熔点
m/z mass to charge ratio (in mass spectrometry) 质荷比NMR nuclear magnetic resonance 核磁共振
d doublet (in spectral) 双峰
s singlet (in spectral) 单峰
t triplet (in spectral) 三重峰
br s broad 宽单峰。