女性盆底细胞机械应力损伤时雌激素受体的变化

基础研究
㊀㊀D O I :１０．３９６９/j
．i s s n ．０２５３Ｇ９９２６．２０１８．１３．０１３基金项目:山西省自然科学基金(２０１２０１１０３８Ｇ１１
)作者单位:０３０００１太原,
山西医科大学第一医院妇科女性盆底细胞机械应力损伤时雌激素受体的变化
赵㊀烨㊀郭婷婷㊀李苗苗
㊀㊀女性盆底由肌肉㊁筋膜构成复合体承载盆腔器官并调节其生理功能,盆底结构的损伤缺失会导致
盆底功能障碍性疾病(p e l v i cd y
s f u n c t i o nd i s e a s e ,P F D ).P F D 是中老年女性常见病,
包括盆腔器官脱垂㊁压力性尿失禁,出现活动或腹压增加相关的阴道肿物突出㊁排尿排便异常㊁慢性盆腔痛等症状,
虽不危及生命,但严重影响生活质量.妊娠㊁经阴分娩是发生盆底肌损伤最常见的原因,而绝经是促成盆腔器官脱垂的重要因素,所以雌激素与疾病发生关系受到关注.本文采用细胞柔性基底拉伸系统构成盆底骨骼肌细胞及肌间成纤维细胞的机械性损伤,通过观察雌激素受体(E R )的变化,初步探讨雌激素与盆底肌损伤的相关性.
１㊀材料与方法
１．１㊀标本取材及原代细胞培养:取自山西医科大学第一医院腹会阴联合直肠癌根治术育龄期患者
和绝经期患者的盆底肌约５m m .显微镜下鉴定为骨骼肌组织.标本取材后反复冲洗㊁剪碎㊁消化㊁离心,差速贴壁１h 内获取成纤维细胞,２h 后贴壁获
取成肌细胞.计数后按１ˑ１０４
/m L 的密度接种,
３７ħ,５％C O ２孵箱中培养.用结蛋白抗体免疫组
织化学染色,成肌细胞鉴定;用波形蛋白免疫染色鉴定成纤维细胞.
１．２㊀主要试剂与实验设备:D M E M 高糖培养基(H Y C L O N E ),胎牛血清(杭州四季青),０．２５％胰蛋白酶(G i b c o 公司),胶原酶(S i g m a 公司),结蛋白单克隆抗体(博奥森).F l e x e r c e l l ４０００柔性基底拉伸系统(太原理工大学)
.１．３㊀细胞加载力实验:
选择体外培养的第２~５代稳定传代的细胞,按照１０５
/孔的密度接种于６孔B i o ＧF l e x 柔性基底加载板,利用F l e x c e l l Ｇ４０００柔性
基拉伸系统持续加载机械力,加载力频率３H z ,加力强度６％持续６h .
１．４㊀E R 定量测定:链霉素抗生物素蛋白Ｇ
过氧化物连接法(S P )检测成肌细胞与成纤维细胞E R α㊁E R β的含量,设置阴性对照,以已知E R α/E R β阳性
表达的乳腺癌组织为阳性对照.采用组织化学评分法(H Ｇs c o r e )进行结果判定.每张切片观察５个视野,以之代表阳性棕黄色颗粒染色深浅,共０~３分,代表细胞所占比例,求和.
１．５㊀统计学处理:采用S P S S１７．０软件,
实验数据以 x ʃs 表示,比较采用单因素方差分析.P ＜０ ０５为差异有统计学意义.
２㊀结㊀㊀果
２．１㊀成肌细胞与成纤维细胞镜下特征:成纤维细胞多于１h 内贴壁,分离传代,倒置显微镜下见呈梭形㊁不规则三角形㊁多角形,免疫组织化学波形蛋白阳性,角蛋白染色阴性,细胞纯度９０％以上.成肌细胞４h 开始贴壁,４８h 完全贴壁,逐渐延展,呈纺锤形,规律延一个方向排列,继而融合,形成多核的肌管.免疫组织化学结蛋白阳性.
２．２㊀细胞加力后形态学变化:
加载３％６h 的机械力,成肌细胞与成纤维细胞均表现为细胞拉伸呈长梭形,沿应力方向取向.绝经期加力组成肌细胞出现了少数细胞破碎.
２．３㊀成肌细胞与成纤维细胞E R 免疫组织化学染色:成肌细胞E R 免疫组织化学呈阴性,成纤维细胞E R 免疫组织化学阳性,
细胞核及细胞质中均表现棕黄色颗粒.见表１.
表１㊀成纤维细胞中E R αE R β表达的比较(
％)( x ʃs )组别
例数E R α
E R β
育龄期加载力组１２０．２１ʃ０．１８
１)
０．６８ʃ０．０６
１)
未加力组１２０．３４ʃ０．０９㊀
０．７１ʃ０．２１㊀绝经期
加载力组１２
０．０８ʃ０．１２２)０．１９ʃ０．１１
２)
未加力组
１２０．１６ʃ０．０８㊀
０．２７ʃ０．０３㊀
㊀㊀１)与育龄期未加力组比较P ＜０．０５.㊀㊀２)与绝经期未加力组比较P ＜０．０５.
３㊀讨㊀㊀论
盆底功能障碍的损伤源于盆底肌还是盆腔筋膜的争论持续了百年,近年来伴随盆底学㊁盆底重建完科学的建立与发展,新理论的提出㊁新技术的
应用,人们普遍认可并接受盆腔整理理论.其中肛提肌的肌力正常保证了盆底支撑的张力,同时调控排尿㊁排便.肛提肌的损伤包括附着点的断裂㊁肌纤维的变性坏死㊁肌肉神经营养缺乏等.而雌激素与肛提肌损伤修复间的关系并没有更为清晰的认识.
３．１㊀机械力对盆底肌损伤:妊娠㊁分娩是盆底肌损伤的直接原因[１],肛提肌由于局部肌肉的过度负荷或反复性用力导致损伤,表现出肌力下降㊁肌电活动异常㊁组织形态结构的变化.临床观察证实P F D 患者普遍存在肛提肌收缩力量减弱,肌电图提示肛提肌运动单元缺失和中枢激活障碍.P F D患者肛提肌纤维直径密度减小,排列紊乱,被大量的结缔组织填充.单个肌纤维既有核中心移位㊁纤维劈裂㊁外周吞噬及空泡变性等肌源性改变,也有肌纤维萎缩㊁角型变㊁同型纤维聚集等神经源性改变.多数学者认为分娩是肛提肌损伤的主要原因[２],２０％初产妇产后发生部分肛提肌组织损伤,表现为肌肉变细甚至断裂,产钳㊁巨大胎儿㊁第二产程延长均是分娩中导致肛提肌损伤的主要危险因素.基于磁共振成像(M R I)构建的肛提肌三维模型进行有限元分析,证实第二产程末遭受最强拉伸的部位是耻尾肌中段,提示该区域最易发生机械性损伤.我们在之前的研究中观察不同应力强度㊁应力时间对成肌细胞的损伤[３],成为实现后续研究的基础.３．２㊀绝经相关的盆底肌的变化:肛提肌功能下降与衰老的关系,８％~３２％的未曾生育过的妇女亦会出现肛提肌收缩功能的下降[４].P F D患者往往是损伤发生后多年以后,症状渐严重遂就诊,说明雌激素和P F D发病有密切关系.有学者认为P F D 是一种源于盆底支持组织生物力学性质进行性减退导致的疾病.所以伴随着绝经的雌激素变化与P F D的关系,P F D患者性激素替代是否有助于治疗引发了一些学者的思考.更多的学者会在治疗中考虑局部使用雌激素作为辅助.盆底组织E R 的表达差异存在于P O P患者中[５],而且绝经前与绝经后P F D患者E R的表达是有差异的[６].３．３㊀雌激素与盆底肌的应力变化:随着近年来产后盆底康复技术的广泛应用,证实了产后及早开展康复治疗有助于盆底肌的部分功能恢复,而对于围绝经期女性的反馈治疗却效果不满意[７].源于美国激素替代人群的数据显示,激素替代对于盆腔器官脱垂的治疗没有作用,甚至可能加重压力性尿失禁的症状[８].有学者认为可能是由于绝经期盆底组织中E R表达下降有关.然而骨骼肌不表达E R,所以肛提肌对雌激素调节的反应可能是由于
肛提肌肌膜的间接作用.近年来,激素替代出现了 窗口期 理论,是否也适用盆底功能障碍性疾病,仍然需要进一步的循证医学证据.P F D的发生与雌激素下降有关,却与E R的差异表达没有关系[９,１０],应该更多的是源于机械性损伤.然而盆底肌的修复,雌激素介导了积极的作用.我们认为E R表达在女性不同生命周期中的不可避免变化可能影响生殖道脱垂的风险,可能有助于进一步寻找合适的选择性E R调节剂作为治疗盆腔器官脱垂的妇女.
参考文献
[１]F r i e d m a nT,E s l i c kG D,D i e t zH P．R i s k f a c t o r s f o r p r o l a p s e r e c u r r e n c e:s y s t e m a t i cr e v i e wa n d m e t aＧa n a l y s i s[J]．I n t e r n
U r o g y n e c o l J,２０１８,２９(１):１３Ｇ２１．
[２]C a u d w e l lＧH a l l J,A t a n I K,B r o w nC,e t a l．C a n p e l v i c f l o o r t r a u m ab e p r e d i c t e da n t e n a t a l l y?[J]．A c t aO b s t e tG y n e c o l S c a n d,２０１８,９７(６):７５１Ｇ７５７．
[３]李苗苗．盆底骨骼肌细胞受力前后的超微结构变化[D]．太原:山西医科大学,２０１３．
[４]孙智晶,朱兰,郎景和,等．盆底肌肉训练在盆底功能障碍性疾病防治中的作用[J]．中华妇产科杂志,２０１７,５２(２):１３８Ｇ１４０．
[５]陈远群,任慕兰．盆腔器官脱垂盆底组织的雌激素受体变化研究[J]．中国妇幼健康研究,２０１０,２１(１):２４Ｇ２５．[６]Z b u c k a k r e t o w s k a M,M a r c u s b r a u nN,E b o u eC,e t a l．E xＧ
p r e s s i o no f e s t r o g e nr e c e p t o r s i nt h e p e l v i cf l o o ro f p r eＧa n d
p o s tＧm e n o p a u s a l w o m e n p r e s e n t i n gp e l v i c o r g a n p r o l a p s e[J]．
F o l i aH i s t o c h e m C y t o b i o l,２０１１,４９(３):５２１Ｇ５２７．[７]孙智晶,朱兰,郎景和,等．初产妇产后６周盆底电生理指标及盆腔器官脱垂分度状况全国多中心横断面研究[J]．中国实
用妇科与产科杂志,２０１５,３１(５):４３３Ｇ４３９．
[８]赵琦．雌激素替代治疗女性压力性尿失禁[J]．中华现代妇产科学杂志,２００８,４(５):４１０Ｇ４１３．
[９]艾比布汗 阿布来孜．新疆维㊁汉女性盆腔器官脱垂患者雌激素受体S N P位点差异性分析[D]．乌鲁木齐:新疆医科大
学,２０１６．
[１０]N a k a dB,F a r e sF,A z z a m N,e ta l．E s t r o g e nr e c e p t o ra n d l a m i n i n g e n e t i c p o l y m o r p h i s ma m o n g w o m e n w i t h p e l v i co rＧ
g a n p r o l a p s e[J]．I n t e r nU r o g y n e c o l J,２０１７,２６(６):S１４８．
(收稿日期:２０１８Ｇ０４Ｇ０８)。