色谱_质谱联用技术在代谢组学中的应用
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2 液相色谱 质谱联用 (LC MS )
高效液相色谱 (HPLC)具有分离效率高、 分析 速度快、 应用范围广等特点 , 与 GC 相比, 不受样品 挥发性和热稳定性影响, 是一种更加普适性的分析 手段。当其与 M S联用时 , 能够集 HPLC 高分离性 能和 M S高灵敏度、 高专属性的优点于一体, 且具有 提纯和制备单一物质的能力。与 GC 相比, 样品可 以在简单的预处理之后直接用 HPLC 进行分析, 避 免了衍生化等繁杂的预处理。目前, LC M S技术已 [ 21, 40- 42] 发展成 为代谢组 学研究的 主流技术 手段 。 O giso等 建立了反相液相色谱 (RPLC) M S 测定 磷脂酰肌醇磷酸盐的方法, 分析了 A431 细胞中表 皮生长因子诱导分子水平的代谢变化 , 该方法具有 灵敏度高 , 检测范围宽等优点。我们 用反相液相 色谱 离子阱 傅里叶变换质谱 ( RPLC Ion T rap FT M S)方法测定 p53 基因突变模型老鼠的血浆, 一次 进样能检测出超过 160种磷脂。 反相色谱方法是分析非极性和中等极性化合物 的常规手段, 但反相色谱柱对强极性的化合物无法 保留 , 损失了这些强极性样品的信息, 此时可选择亲 水相互 作用 色 谱 ( H IL IC) 代 替 常规 的 反相 色 谱。 H IL IC 是一种以极性固定相 (如硅胶或衍生硅胶 )及 含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的
*
(CAS K ey La bora tory of S epa ra tion Scie n ce for Ana ly tica l Che m istr y, Da lian In stitu te o f Che m ica l Phy sics,
A bstract : M etabonom ics ( orm etabolom ics) is one o f p latform s for function genom ic s and sys tem s b io logy . M etabonom ics focuses on the changes of low m o lecu larm ass m etabo lites in com plex sa m p les such as b ioflu ids , cells and tissue / tissue extracts . Although it has no t been possi ble for quantitative m easurem ents o f g lobalm etabo lite profiling , the com b ination o f chrom atog raphy m ass spectrom etry and chem om etrics has secured a central ro le in m etabonom ics re search. Here , app lications o f chrom atography m ass spectrom etry in m etabonom ics are reviewed , the advan tages and disadvan tages o f various separation techn iques includ ing gas chrom atography , liqu id chrom atography and cap illary e le ctrophoresis are e m phas ized , their fur ther deve lopm en ts in m etabonom ics field are prospected. K ey words: chrom atography ; m ass spectrom etry ; m etabonom ics /m etabo lom ics ; m etabo lite pro filing 近年来 , 随着系统生物学的迅猛发展 , 研究者已 开始注重从生物系统的整体性分析入手, 了解复杂 的生命过程 , 寻找疾病的早期诊断和治疗方法。代 谢组学 (m etabonom ics , 即 m etabo lom ics) 是继 基因 组 学 ( genom ics )、 转 录 组 学 ( transcrip tom ics)、 蛋白质组学 ( pro teom ics)之后系统生物学的 主 要 研 究 平台 , 并 逐 渐 成 为 生 命 科 学 的 研究 热 [3 , 4] 点 。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰 动后 (如将某个特定的基因变异或环境变 化后 )其 代谢产物的变化或其随时间的变化, 来研究生物体 [ 1] 系的代谢途径的一种 技术 。其研 究目标是对体 液、 组织、 细胞等生物样本中相对分子质量 (M r )为
[ 11- 13] [ 10]
* 通讯联系人 : 许国旺 , 研究员 , 博士生导师 . T e: l ( 0411 ) 84379530, E m ai: l xugw@ dicp. ac . cn. 基金项目 : 国家自然科学重点基金项目 ( No. 20835006)和面上基金项目 ( No. 20675082). 收稿日期 : 2009 08 26
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1 000 以下的所有小分子代谢物进行定性和定量分 析, 从而得到生物体受外界刺激后其代谢水平的整 [ 5- 9] 体变化的结果 。 代谢组学研究的基本流程包括样品采集、 预处 理、 代谢组分析、 数据分析以及研究结果的解释与应 用等 。代谢组学的样品预处理 和分析技术要尽 量满足对代谢组分的高灵敏度、 高通量、 无偏性的要 求, 并减少基质的干扰 。完整的样品预处理方 法包括样品快速转移、 淬灭、 代谢物定量提取以及最 [ 12] 合适的样品预处理条件等 。 与基因组学不同 , 代谢组学样品中代谢物的数 目通常 未 知, 如 在人 类中 , 代谢 物 的数 目 可能 在
App lications of chrom atography m ass spectro m etry in m etabonom ics
HUANG Q iang , YIN Peiy uan, LU X in, KONG Hongw e,i XU Guowang
th e Chin ese A cade m y of Scie n ces, Da lian 116023, Ch in a )
2009年 9月 Sep te m ber 2009
色
谱
Ch inesБайду номын сангаас Journal of Chro m atography
Vo . l 27 N o . 5 566~ 572
色谱 质谱联用技术在代谢组学中的应用
黄 强, 尹沛源, 路 鑫, 孔宏伟, 许国旺
*
(中国科学院大连 化学物理研究所 , 中国科学院分离分析化学重点实验 室 , 辽宁 大连 116023) 摘要 : 代谢组学是对生物体受外部刺激所产生的小分子 代谢产 物的变 化或其 随时间的 变化进 行研究 的一门 学科 , 以实现对体液、 细胞以及组织提取物等 复杂的 生物样本 中所有 代谢产 物的定 性和定 量分析 为研究目 标。色谱 质 谱联用技术在代谢组学 的研究中已显示出极大的发展潜力。本文主 要综述近 年来代谢组 学研究中涉 及的色谱 质 谱联用技术及其数据处 理方法 , 重点介绍各种分离技术 的特点 及其在 应用中 的关键问 题 , 并对其在 代谢组 学应用 中的未来发展给予展望 。 关键词 : 色谱 ; 质谱 ; 代谢组学 ; 代谢谱 中图分类号 : O 658 文 献标识码 : A 文章编号 : 1000 8713 ( 2009 ) 05 0566 07 栏目类别 : 专论与综述
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一步的分离 , 所有 组分从 第二 根色 谱柱 进入检 测 [ 35, 36] 器 。 GC GC 有 别于中心切割的二维 气相色 谱 (GC+ GC)。 GC + GC 是把第一根色谱柱流出的 部分馏分转移到第二根色谱柱上进行进一步分离, 峰容量是两根柱的峰容量之和 ; 而 GC GC 是两根 柱的峰容量之积, 因而大大提高了分离系统的分辨 率。由于 GC GC在第二维上的分离非常快 , 一般 使用 F ID 做检测器, 与质谱联用时仅 TOF M S能够 实现快速扫描。 GC GC 越来越多地应用于石油化工、 环境保 护、 药物 开发、 植物 研究等 复杂 样品的 分离分 析。 [ 37] V az Fre ire 等 用顶空 固相微萃取 方法处理 得到 橄榄油中的芳香化合物 , 用 GC GC TOF M S检测 得到指纹图谱。基于 GC GC TOF M S技术平台, [ 38] 我们 分析了糖尿病患者和正常人的血浆代谢谱, 峰匹配后用正交信号滤噪 偏最小二乘法辨别分析 法 (OSC PLSDA)找到了在糖尿病患者中浓度明显 [ 39] 变化的葡萄糖等 5 种潜在标志物。 Koek等 通过 实验证明 , 在代谢组学研究中应用 GC GC M S 可 以减少基质干扰、 增大峰容量 , 与采用一维 GC M S 相比 , GC GC M S更适合于生物样品的定量分析。 可以预期 , GC GC 技术将会在复杂混合物的分离 分析尤其是代谢组学的研究中发挥更大的作用。
1 气相色谱 质谱联用 (GC M S)
气相色谱作为一项成熟的分析技术可连接多种 检测器 , 在代谢组学中以火焰离子化检测器 ( FID ) 和质谱检测器最为常见。质谱检测器可以通过标准 谱图库提供化合物结构信息 , 并具有高灵敏度等优 势 , 因而非常适合于代谢组学的研究。对极性强、 挥 发性低、 热稳定 性差 的物质 需要 衍生 化后再 进行 [ 25] GC M S分析 。衍生化不仅可以改善分析对象的 挥发 性、 峰 形、 分 离 度, 也 可 提 高 检 测 的 灵 敏 [ 26- 29 ] [ 30] 度 。 W inder等 用气相色谱 飞行时间质谱 (GC TOF M S)技术对大肠杆菌提取物进行了全组 分分析 , 建立了细胞淬灭和胞内物质提取的评价方 法 , 证明统计分析方法和实验结合才能实现胞内物 质的精确定量。 D ing 等 利用 GC TOF M S测定 工业酒精连续发酵和一次性发酵过程中酵母细胞内 代谢物质的差异 , 分别检测到 143 和 128 种化合物。 在转基因水稻研究中 , 我们 用 GC FID 分析野生 型和转基因型 水稻代谢表型 的差异, 用 GC M S 鉴 定了在转基因和环境影响下水稻中含量均有显著性 差异的代谢物, 对转基因水稻的安全性进行了初步 的研究。类似 地, 我们应用 GC M S 技术也进行了 转基因青蒿各生长阶段代谢表型的研究, 发现了转 基因青蒿代谢物发生显著变化的时期, 实现了代谢 [ 33 , 34 ] 组学的动态分析 。 在对复杂样品进行分析时 , 由于峰容量的限制 , 一维色谱很难达到理想的分离效果, 多维色谱是改 进分辨率的办法之一。全二维气相色谱 (GC GC) 把分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以串联 方式连接在一起 , 这两根色谱柱之间装有一个调制 器 (调制器起捕集再传送的作用 ), 经第一柱分离的 组分由调制器聚焦后以脉冲方式进入第二柱进行进
第 5期
[ 14]
黄
强, 等 : 色谱 质谱联用技术在代谢组学中的应用
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3 000~ 100 000 之间 。不仅如此, 代谢物的浓度 分布范围也很宽 , 有 7~ 9个数量级。由于分析样品 数目多、 差异大、 浓度分布范围广、 组成复杂, 目前尚 没有能够完全满足高灵敏度、 高分辨率和高通量的 [ 15] 无歧视性的代谢物分析平台, W ish art 等 认为目 前的任何一种分析技术一次分析只能获得占全部代 谢物数量 10 % ~ 15 % 的代谢物信息。要实现普遍适 应性和特殊选择性的有机结合 , 需要多种分析技术 的互补 。目前主要采用的分析技术有核磁共 [ 19- 22] 振谱 (NM R)、 质谱 (M S)、 色谱、 光谱等 。色谱 与质谱的联用结合了两者的优势, 因而在代谢组学 研究中已成为重要的分离分析技术 。 本文试图通过选择典型实例, 综述近年来色谱 质谱联用技术在代谢组学研究中的应用及其最新的 研究进展。
2 液相色谱 质谱联用 (LC MS )
高效液相色谱 (HPLC)具有分离效率高、 分析 速度快、 应用范围广等特点 , 与 GC 相比, 不受样品 挥发性和热稳定性影响, 是一种更加普适性的分析 手段。当其与 M S联用时 , 能够集 HPLC 高分离性 能和 M S高灵敏度、 高专属性的优点于一体, 且具有 提纯和制备单一物质的能力。与 GC 相比, 样品可 以在简单的预处理之后直接用 HPLC 进行分析, 避 免了衍生化等繁杂的预处理。目前, LC M S技术已 [ 21, 40- 42] 发展成 为代谢组 学研究的 主流技术 手段 。 O giso等 建立了反相液相色谱 (RPLC) M S 测定 磷脂酰肌醇磷酸盐的方法, 分析了 A431 细胞中表 皮生长因子诱导分子水平的代谢变化 , 该方法具有 灵敏度高 , 检测范围宽等优点。我们 用反相液相 色谱 离子阱 傅里叶变换质谱 ( RPLC Ion T rap FT M S)方法测定 p53 基因突变模型老鼠的血浆, 一次 进样能检测出超过 160种磷脂。 反相色谱方法是分析非极性和中等极性化合物 的常规手段, 但反相色谱柱对强极性的化合物无法 保留 , 损失了这些强极性样品的信息, 此时可选择亲 水相互 作用 色 谱 ( H IL IC) 代 替 常规 的 反相 色 谱。 H IL IC 是一种以极性固定相 (如硅胶或衍生硅胶 )及 含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的
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(CAS K ey La bora tory of S epa ra tion Scie n ce for Ana ly tica l Che m istr y, Da lian In stitu te o f Che m ica l Phy sics,
A bstract : M etabonom ics ( orm etabolom ics) is one o f p latform s for function genom ic s and sys tem s b io logy . M etabonom ics focuses on the changes of low m o lecu larm ass m etabo lites in com plex sa m p les such as b ioflu ids , cells and tissue / tissue extracts . Although it has no t been possi ble for quantitative m easurem ents o f g lobalm etabo lite profiling , the com b ination o f chrom atog raphy m ass spectrom etry and chem om etrics has secured a central ro le in m etabonom ics re search. Here , app lications o f chrom atography m ass spectrom etry in m etabonom ics are reviewed , the advan tages and disadvan tages o f various separation techn iques includ ing gas chrom atography , liqu id chrom atography and cap illary e le ctrophoresis are e m phas ized , their fur ther deve lopm en ts in m etabonom ics field are prospected. K ey words: chrom atography ; m ass spectrom etry ; m etabonom ics /m etabo lom ics ; m etabo lite pro filing 近年来 , 随着系统生物学的迅猛发展 , 研究者已 开始注重从生物系统的整体性分析入手, 了解复杂 的生命过程 , 寻找疾病的早期诊断和治疗方法。代 谢组学 (m etabonom ics , 即 m etabo lom ics) 是继 基因 组 学 ( genom ics )、 转 录 组 学 ( transcrip tom ics)、 蛋白质组学 ( pro teom ics)之后系统生物学的 主 要 研 究 平台 , 并 逐 渐 成 为 生 命 科 学 的 研究 热 [3 , 4] 点 。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰 动后 (如将某个特定的基因变异或环境变 化后 )其 代谢产物的变化或其随时间的变化, 来研究生物体 [ 1] 系的代谢途径的一种 技术 。其研 究目标是对体 液、 组织、 细胞等生物样本中相对分子质量 (M r )为
[ 11- 13] [ 10]
* 通讯联系人 : 许国旺 , 研究员 , 博士生导师 . T e: l ( 0411 ) 84379530, E m ai: l xugw@ dicp. ac . cn. 基金项目 : 国家自然科学重点基金项目 ( No. 20835006)和面上基金项目 ( No. 20675082). 收稿日期 : 2009 08 26
[ 1, 2]
1 000 以下的所有小分子代谢物进行定性和定量分 析, 从而得到生物体受外界刺激后其代谢水平的整 [ 5- 9] 体变化的结果 。 代谢组学研究的基本流程包括样品采集、 预处 理、 代谢组分析、 数据分析以及研究结果的解释与应 用等 。代谢组学的样品预处理 和分析技术要尽 量满足对代谢组分的高灵敏度、 高通量、 无偏性的要 求, 并减少基质的干扰 。完整的样品预处理方 法包括样品快速转移、 淬灭、 代谢物定量提取以及最 [ 12] 合适的样品预处理条件等 。 与基因组学不同 , 代谢组学样品中代谢物的数 目通常 未 知, 如 在人 类中 , 代谢 物 的数 目 可能 在
App lications of chrom atography m ass spectro m etry in m etabonom ics
HUANG Q iang , YIN Peiy uan, LU X in, KONG Hongw e,i XU Guowang
th e Chin ese A cade m y of Scie n ces, Da lian 116023, Ch in a )
2009年 9月 Sep te m ber 2009
色
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Ch inesБайду номын сангаас Journal of Chro m atography
Vo . l 27 N o . 5 566~ 572
色谱 质谱联用技术在代谢组学中的应用
黄 强, 尹沛源, 路 鑫, 孔宏伟, 许国旺
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(中国科学院大连 化学物理研究所 , 中国科学院分离分析化学重点实验 室 , 辽宁 大连 116023) 摘要 : 代谢组学是对生物体受外部刺激所产生的小分子 代谢产 物的变 化或其 随时间的 变化进 行研究 的一门 学科 , 以实现对体液、 细胞以及组织提取物等 复杂的 生物样本 中所有 代谢产 物的定 性和定 量分析 为研究目 标。色谱 质 谱联用技术在代谢组学 的研究中已显示出极大的发展潜力。本文主 要综述近 年来代谢组 学研究中涉 及的色谱 质 谱联用技术及其数据处 理方法 , 重点介绍各种分离技术 的特点 及其在 应用中 的关键问 题 , 并对其在 代谢组 学应用 中的未来发展给予展望 。 关键词 : 色谱 ; 质谱 ; 代谢组学 ; 代谢谱 中图分类号 : O 658 文 献标识码 : A 文章编号 : 1000 8713 ( 2009 ) 05 0566 07 栏目类别 : 专论与综述
[ 23, 24] [ 16- 18 ]
一步的分离 , 所有 组分从 第二 根色 谱柱 进入检 测 [ 35, 36] 器 。 GC GC 有 别于中心切割的二维 气相色 谱 (GC+ GC)。 GC + GC 是把第一根色谱柱流出的 部分馏分转移到第二根色谱柱上进行进一步分离, 峰容量是两根柱的峰容量之和 ; 而 GC GC 是两根 柱的峰容量之积, 因而大大提高了分离系统的分辨 率。由于 GC GC在第二维上的分离非常快 , 一般 使用 F ID 做检测器, 与质谱联用时仅 TOF M S能够 实现快速扫描。 GC GC 越来越多地应用于石油化工、 环境保 护、 药物 开发、 植物 研究等 复杂 样品的 分离分 析。 [ 37] V az Fre ire 等 用顶空 固相微萃取 方法处理 得到 橄榄油中的芳香化合物 , 用 GC GC TOF M S检测 得到指纹图谱。基于 GC GC TOF M S技术平台, [ 38] 我们 分析了糖尿病患者和正常人的血浆代谢谱, 峰匹配后用正交信号滤噪 偏最小二乘法辨别分析 法 (OSC PLSDA)找到了在糖尿病患者中浓度明显 [ 39] 变化的葡萄糖等 5 种潜在标志物。 Koek等 通过 实验证明 , 在代谢组学研究中应用 GC GC M S 可 以减少基质干扰、 增大峰容量 , 与采用一维 GC M S 相比 , GC GC M S更适合于生物样品的定量分析。 可以预期 , GC GC 技术将会在复杂混合物的分离 分析尤其是代谢组学的研究中发挥更大的作用。
1 气相色谱 质谱联用 (GC M S)
气相色谱作为一项成熟的分析技术可连接多种 检测器 , 在代谢组学中以火焰离子化检测器 ( FID ) 和质谱检测器最为常见。质谱检测器可以通过标准 谱图库提供化合物结构信息 , 并具有高灵敏度等优 势 , 因而非常适合于代谢组学的研究。对极性强、 挥 发性低、 热稳定 性差 的物质 需要 衍生 化后再 进行 [ 25] GC M S分析 。衍生化不仅可以改善分析对象的 挥发 性、 峰 形、 分 离 度, 也 可 提 高 检 测 的 灵 敏 [ 26- 29 ] [ 30] 度 。 W inder等 用气相色谱 飞行时间质谱 (GC TOF M S)技术对大肠杆菌提取物进行了全组 分分析 , 建立了细胞淬灭和胞内物质提取的评价方 法 , 证明统计分析方法和实验结合才能实现胞内物 质的精确定量。 D ing 等 利用 GC TOF M S测定 工业酒精连续发酵和一次性发酵过程中酵母细胞内 代谢物质的差异 , 分别检测到 143 和 128 种化合物。 在转基因水稻研究中 , 我们 用 GC FID 分析野生 型和转基因型 水稻代谢表型 的差异, 用 GC M S 鉴 定了在转基因和环境影响下水稻中含量均有显著性 差异的代谢物, 对转基因水稻的安全性进行了初步 的研究。类似 地, 我们应用 GC M S 技术也进行了 转基因青蒿各生长阶段代谢表型的研究, 发现了转 基因青蒿代谢物发生显著变化的时期, 实现了代谢 [ 33 , 34 ] 组学的动态分析 。 在对复杂样品进行分析时 , 由于峰容量的限制 , 一维色谱很难达到理想的分离效果, 多维色谱是改 进分辨率的办法之一。全二维气相色谱 (GC GC) 把分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以串联 方式连接在一起 , 这两根色谱柱之间装有一个调制 器 (调制器起捕集再传送的作用 ), 经第一柱分离的 组分由调制器聚焦后以脉冲方式进入第二柱进行进
第 5期
[ 14]
黄
强, 等 : 色谱 质谱联用技术在代谢组学中的应用
567
3 000~ 100 000 之间 。不仅如此, 代谢物的浓度 分布范围也很宽 , 有 7~ 9个数量级。由于分析样品 数目多、 差异大、 浓度分布范围广、 组成复杂, 目前尚 没有能够完全满足高灵敏度、 高分辨率和高通量的 [ 15] 无歧视性的代谢物分析平台, W ish art 等 认为目 前的任何一种分析技术一次分析只能获得占全部代 谢物数量 10 % ~ 15 % 的代谢物信息。要实现普遍适 应性和特殊选择性的有机结合 , 需要多种分析技术 的互补 。目前主要采用的分析技术有核磁共 [ 19- 22] 振谱 (NM R)、 质谱 (M S)、 色谱、 光谱等 。色谱 与质谱的联用结合了两者的优势, 因而在代谢组学 研究中已成为重要的分离分析技术 。 本文试图通过选择典型实例, 综述近年来色谱 质谱联用技术在代谢组学研究中的应用及其最新的 研究进展。