神经干细胞体外培养技术

神经干细胞体外培养与鉴定
一前言
神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。

文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。

此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。

根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。

基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。

本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。

二实验所需仪器、试剂及其配制
（一）实验仪器
光学显微镜（Olympus,Japan）
倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）
冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）
光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）
XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)
MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)
10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLING
CORP，BATON ROUGE，
LOUISIANA，Made in USA）
0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）
手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。

（二）试剂
1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。

2. 碳酸氢钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钾，氯化钠，多聚甲醛等为国产分析纯试剂，谷氨酰胺，青霉素，链霉素。

（三）主要试剂的配制
1. 基础培养基DMEM/F12 1:1的配制
DMEM粉剂 1.34g，F12 1.06g。

（1）称取以上试剂量后放入200ml烧杯中。

（2）加三蒸水至200ml搅拌溶解。

（3）用1mol/LNaOH或 1mol/LHCl调pH值为7.20。

（4）过滤分装，置4℃冰箱保存。

2. D-Hanks液（g/L）的配制
KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，酚红 0.01g。

（1）称取以上试剂量。

（2）取1000ml烧杯盛约700ml三蒸水，依次加入所称试剂量溶解。

（3）再加足水至1000ml。

（4）用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH值为7.20。

（5）过滤分装，置4℃冰箱保存。

3. 抗生素液配制
青霉素 1×106 IU/甁，链霉素 1g/瓶。

加入0.9%无菌的生理盐水50ml，即可配制成青霉素浓度为2×104 IU/ml，链霉素浓度为20mg/ml液体，无菌分装，-20℃保存，使用时稀释成青霉素工作浓度为100IU/ml、链霉素为100μg/ml。

4. bFGF
-20℃保存，使用时用三蒸水稀释至20ng/ml的工作浓度。

5. 3.6%水合氯醛溶液的配制：
称取3.6g水合氯醛置于250ml量筒中，加入少量无菌生理盐水溶解后定容至100ml。

6. 培养液的准备
DMEM/F12 1:1 100ml
GB液9ml 混合后，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗（青、链霉素）各0.25ml 每瓶分装为10-20 ml，4℃储存。

bFGF 2 μg
B27 1ml
7. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液的配制：
称取40g多聚甲醛置于1000ml烧杯中，加入0.1 mol/L PBS 800ml，60℃加热至多聚甲醛完全溶解为止，冷却后滴加1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH溶液，用PHS-3C型精密pH计调整pH值在7.2-7.4之间，添加0.1 mol/L PBS定容至1000ml，4℃冰箱内保存备用。

8. 铬明胶溶液的配制：
分别称取5g明胶和0.5g铬明矾，用60℃ 800ml左右的单蒸水先溶解明胶后，再加入铬明矾，待完全溶解后定容至1000ml，过滤，用于包被玻片。

包被时将玻片浸入60℃的铬明胶溶液中15-20min，取出后37℃烤干备用。

9. 20%、25%、30%蔗糖溶液的配制：
分别取蔗糖20g，25g，30g，分别用0.1 mol/L PB缓冲液溶解后，定容至100ml。

三实验步骤
（一）神经干细胞悬液制备
取孕E12～14d的GFP转基因小鼠，用75％乙醇浸泡消毒GFP转基因孕鼠。

无菌条件下，剪开腹部皮肤及皮下筋膜，暴露并分离子宫，取出子宫，将其放入含D-Hanks液的培养皿中清洗。

用剪刀，镊子分离胎鼠（10∼12d），取其头部，在解剖显微镜下用纤维剪，镊暴露大脑, 无菌条件下分离脑膜获取海马, 制成1mm3组织块，剪碎并反复吹打制成细胞悬液，加入DMEM/F12 1:1（Hyclone）培养液（其中添加1％N2（Gibico），20μg/L bFGF（Invitrogen），2mmol/L谷氨酰胺，50000U/L青霉素，50mg/L链霉素），用吸管吹打20－30次，细胞滤网过滤后制成单细胞悬液，
（二）细胞计数
1. 取10μl细胞悬液，加入1%台盼蓝试剂计数存活细胞，计算细胞总数。

具体操作方法为：用10μl的移液枪吸取细胞，让枪头在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片下被液体充满为止。

3. 置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。

对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4. 按下式计算细胞悬液的密度：细胞密度=（4大格细胞总数/4）×10000（个/ml）。

按此公式，测得细胞密度。

（三）神经干细胞培养
调整细胞浓度为5×105个/ml，加入无血清的NSCs培养基，成份为DMEM/F-12 1:1(Hyclone)，添加1％N2(Gibico)，20μg/L 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Invitrogen)，2mmol/L谷氨酰胺，10000U/L青霉素，10mg/L链霉素。

接种于24孔培养板，37℃ 5%CO2培养箱培养。

隔日半量换液1次。

2d即可见有漂浮的神经球形成（图1），5d左右神经球增大，数量增多（图2），传一代后，NSC形态与原代类似（图3）。

（四） 培养神经干细胞的鉴定
根据文献报道（LIU Shi-yong，et al. 2000），我们用针对培养细胞的特异染色抗体Nestin来鉴定培养细胞。

分别将培养纯化的神经球涂于多聚赖氨酸溶液（40g/L）包被的载玻片上制成涂片。

用4%多聚甲醛固定15~20min，0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min；按文献报道的免疫组化两步法（Zhai JW, et al. 2010）染色鉴定细胞。

具体方法简介如下：3%H2O2避光处理30min以灭活内源性过氧化物酶，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min；0.3%TritonX-100 37℃孵育30min；5%羊血清37℃孵育30min以封闭非特异性结合位点；滴加兔Nestin 一抗（Chemicon, 1:100），另一组只滴加0.01mol/L PBS为阴性对照组。

4℃湿盒孵育过夜，0.01mol/L PBST漂洗3次，每次5min，加入酶标羊抗兔IgG（二抗，1:100），37℃孵育30min，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min；DAB显色3~5min 后,用单蒸水终止显色，脱水、透明、裱片，在普通光学显微镜下观察阳性反应产物部位并拍照。

四实验结果
（一），NSC形态学
源于海马的单细胞悬液后接种在24孔培养板1h后，即有细胞贴壁，单个细胞呈球形。

24h后见一些贴壁的扁平细胞，立体感较差，透亮度一般，这些一般是成纤维细胞。

此时将培养液放入另一培养板中继续培养，3d后离心收集细胞并在细胞内加入培养液继续培养。

NSC生长特性为悬浮生长，3d即可见一些克隆球，5d增大，传一代时已较纯。

（图 1A,B）
（二），NSC组化染色鉴定结果
本实验用Nestin免疫组化染色鉴定NSC ，源于GFP的NSC本可发绿色荧光（图2），Nestin染色呈阳性反应(图3)。

（三）结果分析与讨论
本实验显示：培养的神经球呈Nestin免疫染色阳性，说明阳性细胞是NSC。

神经干细胞是一类未成熟细胞，选择性地表达某些抗原标志如巢蛋白(Nestin)。

巢蛋白属中间丝蛋白。

是目前作为神经干细胞的标记分子。

Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失，因而利用Nestin的抗体标记成为我们证明所分离细胞为胚胎早期细胞的重要方法之一。

Schmidt-Kastner 等（Schmidt-Kastner, et al. 2002）在实验中发现从培养2～8周的成年大鼠脑组织切片中可见Nestin持续呈阳性表达，这说明组织中出现了幼稚的神经干细胞。

本实验取胎鼠海马组织进行培养，在显微镜下观察可见圆形细胞团，由数十至数百个细胞组成，免疫组化染色见Nestin阳性，证明培养细胞确为神经干细胞。

关于NSC在体外的生长形态，已有不少文献报道，NSC在培养液中呈漂浮的克隆球生长特性。

最开始接种的细胞单个散存，胞体直径小，一般大约在10μm 左右。

通过24h培养使成纤维细胞等贴壁后，再取出细胞悬液培养，从而使细胞得到纯化。

其内的漂浮细胞继续生长，培养5d可形成较大的神经球。

从本实验结果看，我们所培养的细胞具有NSC生长特性，与文献报道结果一致【】。

加之之前用Nestin染色结果证明培养的细胞表达Nestin抗原，因此说明培养的细胞是NSC，可用于后续实验。