阿尔茨海默病海马CaMKⅡ-α神经元表达的变化

注：单位面积（ mm2 ）内 CaMK!-" 神经元的数目；Mann-Whitney U 检验：* P < 0. 001
A 对照组
B AD 组
图 l 免疫组织化学染色显示海马 CAl 区
CaMK!-" 神经元的分布和染色情况
图 3 AD 组和对照组海马 CAl-CA 亚区 CaMK!-" 神经元平均光密度值比较
3 讨论 CaMK!是一种多功能的蛋白激酶，通过磷酸化许多底物
蛋白来传导 Ca2 + 信号，在神经递质的合成和释放、长程动作 电位（ Long Term potentiation，LTP）以及神经元的可塑性中都 起着重要作用，可定位于神经元胞浆、轴突、树突及突触的前
后膜。本实验观察到 AD 海马内 CaMK!-" 神经元数目在海 马 CA1 区选择性显著减少。海马内神经元的丧失是 AD 的显 著病理特征之一，尤其是 CA1 和 CA2 亚区［4］。所以，AD 海马 CA1 区 CaMK!-" 神经元的减少，不能排除系由 AD 海马内 神经元非特异性丢失所致。但我们的研究发现 CaMK!-" 神 经元选择性在 AD 海马 CA1 区丧失（ P < 0. 001），而其他亚区 神经元减少无显著性差异。由于 CaMK!-" 在学习记忆中起 重要作用［5，6］，此区 CaMK!-" 表达缺失可能会影响 AD 患者
表 l AD 患者和正常老年对照组海马
CAl-CA4 亚区 CaMK!-" 神经元数目比较（ x 1 s）
组别
AD 组 对照组
例数
10 10
海马亚区
CA1
CA2CA3Fra bibliotekCA4
55. 5 120. 8* 209. 9 1 52. 2 167. 7 1 33. 8 62. 0 1 13. 25
120. 7 1 23. 2 252. 1 155. 6 187. 0 150. 3 81. 8 118. 7
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安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2007 January；11（1）
阿尔茨海默病海马 CaMK!-! 神经元表达的变化
王月菊，陈贵海，周江宁，王芬蝶
（ 江苏省苏州大学附属第一医院老年病科，江苏 苏州 215006）
摘要：目的 观察钙调素依赖蛋白激酶!-"（ Caicium / caimoduiin-dependent Protein Kinase-"，CaMK!-"）在阿尔茨海默病（ AD） 患者海马的表达，了解 AD 患者海马表达 CaMK!-" 改变与 AD 学习记忆丧失的可能关系。方法 利用免疫组织化学和体视学 方法定量分析 10 例女性 AD 患者及年龄、性别等与之匹配的 10 例老年对照组海马不同区域 CaMK!-" 神经元数目和染色强度 的差异。结果 AD 海马 CA1 区 CaMK!-" 阳性神经元数目显著减少，残存神经元免疫反应性显著增强。结论 CaMK!-" 的 表达在 AD 海马 CA1 区选择性受损，这可能与 AD 学习记忆丧失相关。 关键词：阿尔茨海默病；钙调素依赖性蛋白激酶!-"；海马
2. 2 AD 患者和老年对照组海马 CaMK!-" 神经元免疫反
应性 AD 和正常对照组海马 CA1-CA4 亚区 CaMK!-" 神经
元染色平均光密度值见图 3，结果显示 AD 患者 CA1 区 CaMK
!-" 神经元染色强度显著高于正常对照组。AD 和正常对照
组其他亚区 CaMK!-" 神经元染色强度未见有显著性。
波炉（700 W）中加热抗原修复，自然冷却 20 min 后 PBS 溶液 洗，5% 羊血清孵育 30min，多克隆兔抗人 CaMK!-" IgG（1f 800） （ Sigma，St. Louis，MO；C6974）孵育过夜，PBS 溶液洗，生物素 结合的羊抗兔 IgG（1 f 200）（ Vector Laboratories，Buriingame， CA）37C 下孵育 1 h，PBS 溶液洗，ABC（1f 200）（ Vector Laboratories）37C 下孵育 1 h，0. 05% DAB 0. 03% 的 H2 O2 快速滴入 显色，对照和 AD 组显色时间同为 5min，快速终止反应。
经元内钙平衡紊乱、神经阻滞和兴奋性损伤各种因素都参与 复杂的病理过程［11］，这也许是 CaMK!表达受损在 AD 海马 CA1 区更加敏感的原因。与对照组相比，虽然 AD 海马 CA1
亚区 CaMK!-" 神经元数目显著减少，但是 CaMK!-" 免疫 反应显著增强。一方面，这可能是细胞代偿的表现。由于该
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见表 1。与对照组相比，AD 患者 CA1 区 CaMK!-" 神经元数
目显著降低（ P < 0. 001），虽然 AD 患者海马其它亚区神经元
数目也较正常对照组少，但未达到统计学差异（ P > 0. 05）。
定量分析主要步骤为在 4 倍物镜下标出海马区范围，测 出其面积，依据随机取样原则取其 50% 区域，切换至 40 倍物 镜下，通过电动 扫 描 平 台 自 动 连 续 捕 获 选 定 区 域 图 像，利 用 Metamorph 生物图像分析软件（ Universai Imaging Corp，美国） 定量分析相关形态学参数，包括计数细胞数目和测量 CaMK !-" 神经元光密度值来评价细胞染色强度。为了在无偏差 条件下获取神经元染色的光密度值，预先设定 RGB 色彩的亮 度和对比度，并在整个实验过程中保持不变。
(uantitative analysis of CaMK!-! expression in the hippocampus of Alzheimer's disease
WANG Yue-ju，CHEN Gui-hai，ZHOU Jiang-ning，WANG Feng-die
（ The First Hospital Affiliated to Suzhou Uniuersity，Department of Geriaticts，Suzhou 215006，China） Abstract：Aim To observe the CaMK!-" expression changes in the hippocampai subfieid of AD patients and the possibie reiationship with iearn memory ioss in AD patients. Methods Sampies of hippocampus of 10 femaie AD patients and 10 non-demented femaie controis matched with age and postmortem deiay were obtained from the netheriands brain bank. The number and opticai density of CaMK!" expressing neurons in the CA1-CA4 subfieids of hippocampus were guantitativeiy anaiyzed with immunohistochemicai and stereoigicai methods. Results CaMK!-" containing neurons were seiectiveiy iost in the CA1 subfieid of AD patients accompanied with the enhanced immunoreactivity of remaining neurons. Conclusions CaMK!-" expression was vuinerabie in CA1 subregion neurons of AD hippocampus which may be invoived in iearn and memory ioss in AD patients. Key words：Aizheimer's disease；caicium / caimoduiin-dependent protein kinase!-"；hippocampus
钙调素依赖蛋白激酶!（ CaMK!）是脑内含量最丰富的 激酶之一，尤其在海马中大量表达。海马内 CaMK!-" 的激 活对神 经 元 的 可 塑 性、基 因 表 达 和 学 习 记 忆 起 着 重 要 作 用［1］。阿尔茨海默病（ Aizheimer disease，AD）是一种以获得 性、进行性记忆减退、认知功能障碍及行为异常为特征的神经 退行性疾病。其特征性神经病理变化是老年斑、神经原纤维 缠结和神经元丢失等。海马（ hippocampus，HP ），这一与学习 记忆关系密切的结构，是 AD 严重受累的区域之一，病理可见 大量老年斑（seniie piagues，SPs）、神经原纤维缠结（neurofibriiiary tangies，NFTs）形成以及神经元丧失。然而，AD 中记忆损 害、NFTs 和 SPs 形成的细胞机制仍不清楚。研究发现 CaMK!" 与 AD 关系密切，目前关于 AD 脑内 CaMK!-" 表达情况的研 究结果并不一致，CaMK!-" 在海马的表达 增 强 或 区 域 性 减 弱［2，3］。本实验用免疫组织化学方法定量分析 AD 海马 CA1CA4 亚区 CaMK!-" 阳性神经元数目和染色强度的变化。 1 对象和方法 1. 1 研究对象 组织材料依据中荷合作项目（00CDP013）由 荷兰脑库提供，其中，AD 脑标本 10 例，均为女性；另取性别、 年龄等与之匹配的老年对照脑标本 10 例，AD 和对照组之间 年龄、死后延搁、脑重量及脑脊液 pH 值差异无显著性（ P 值 分别为 0. 088、0. 096、0. 326、0. 596）。 1. 2 方法 自外侧膝状体水平取海马组织，石蜡包埋，冠状 连续切片，厚度为 6 #m。CaMK!-" 染色采用 ABC 法，组织 切片二甲苯脱腊 2 X 10 min，梯度乙醇进水 5 min / 次，双蒸水 以及 PBS 溶液洗 3 X 5 min 后 0. 3% H2 O2 和 0. 5% Triton 混 合溶液孵育切片 30 min，PBS 溶液洗，0. 1 M 柠檬酸缓冲液微
学习记忆能力。
CaMK!表达受各种因素的调节，黑暗中饲养的大鼠暴露 光照后，CaMK!mRNA 和蛋白的含量均增加［7］。去除短尾猿 单眼可选择性 增 加 纹 状 皮 质 CaMK ! 的 免 疫 反 应 性［8］。相 反，反复边缘系统癫痫发作的大鼠 CaMK!mRNA 的转录和 蛋白表 达 减 少［9］。CaMK ! 对 氧 的 缺 乏 敏 感，啮 齿 动 物 局 部［10］和广 泛 性［5］大 脑 缺 血 可 使 CaMK ! 表 达 减 弱。海 马 CA1 区神经元对于缺血、低血糖和兴奋性损伤最为敏感，这些 都是由钙介导的［2］。AD 海马 CA1 区病理改变最为严重，神
两组间差异用 Mann-Whitney U 检验，结果均使用均值 1 标准差（ x 1 s）表示，P < 0. 05 显示差异有显著性。 2 结果 2. 1 AD 患者和老年对照组海马 CaMK"-! 神经元数目 AD 患者和老年对照组海马 4 个亚区中锥体细胞及齿状回颗 粒细胞均可见 CaMK!-" 免疫阳性反应产物，CaMK!-" 阳性 细胞表现为胞浆着色，胞核空染（ 图 1，2）。可见图 1 对照组， 图 2 AD 组 CaMK!-" 阳性细胞表现为胞浆着色，胞核空染。 与对照组相比 AD 患者 CA1 区神经元的数目显著减少且免疫 反应性显 著 增 强。老 年 对 照 组 和 AD 患 者 海 马 CA1、CA2、 CA3、CA4 4 个亚区单位面积（ mm2 ）内 CaMK!-" 神经元数目