中药血清药理实验方法

★★如果以不同剂量的药物给予动物，取同 体积的血清作为不同剂量药物加入体外反应 系统，则空白血清对照组可只设一组，（等 体积的空白血清）； ★★如果以一种剂量给予动物，以不同体积 的药物血清加入量作为不同剂量组，则空白 对照组应设相应不同加入量的多个对照组。
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4.7.2平行研究
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4.3采血时间
★★标准法 先用少量动物进行预试验，通过不同采血时间进 行比较后确定最佳采血时间。 这种方法得到的结果较为确切，但个体性较强， 同一种药物的不同指标或同一种指标在不同的药物的 达峰时间都不同，所得结果不能通用。
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★★通法 将待测药每天给药2次，连续给药3d，末次给药 后1h采血。
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在实际操作中可以先按通法给药、采血， 如不能得到预期结果，疑为采血时间不当， 再采用标准法确定最佳采血时间。
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4.4 血清预处理
4.4.1什么情况下需要预处理？
★★当空白血清出现显著的阳性反应，严重干扰实 验进行时。 ★★浴槽内的离体器官实验，特别是当浴槽中加入 血清量较多，通氧时形成的大量泡沫，严重妨碍实 验进行时。
中药血清药理实验方法若干问题探讨
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★★临床日用量倍数法
以临床日用量的5， 10，30倍确定给药剂 量；或以整体模型动物的有效剂量（即为临 床成人剂量的8－18倍量）确定剂量为妥。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.2.2 给药次数与时间间隔
★★单次加倍给药法 ★★2次给药法（第1次给药后2h，再以相同剂量重 复1次） ★★3次给药法（连续给药3次，第l间隔20h，第2间 隔4h） ★★7-10d法(1次/d，连用7-10 d） 由于中药及其复方成分复杂,半衰期很难测定,所 以7～10d给药为权宜之计。
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中药血清药理的研究范围
①体外抗菌试验
②体外抗肿瘤试验
③神经细胞、平滑肌细胞、免疫细胞培养试验
④血清药代动力学实验 ⑤药效—药动关联分析
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中药血清药理实验的几个关键技术 4.1动物选择
家兔和大鼠为首选。为减少个体差异的影响，供体动物 至少4只，且雌雄各半，并将每组动物的血清混合。 离体器官、组织、细胞的供体动物和含药血清的供体动 物应具有较好的同质性， 即种属、年龄、性别、体重等方面 相同或相近。
通过加大给药剂量制作的含药血清不能反映正常剂量药物的临 床药效。
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★★血清冻干粉法：
将含药血清制成冷冻干燥粉(冻干粉)，以冻干粉加入反应 系统，使之达到需要的浓度。 所谓“血清冻干粉”，即在制备得含药血清后，首先在冰 箱中冻成固体冰块，然后在-70℃条件下，真空干燥蒸干水分 ，形成干燥粉末。 采用这种方法可以根据需要控制反应系统中的药物浓度。
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中药血清药理实验目的
在体外尽量准确地再现整体实验时药 物与机体相互作用的真实过程，揭示药物 作用的时效关系和量效关系。 血清药理学方法属于半体内实验方法。
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中药血清药理实验思路 动物灌服中药或复方制剂后，在一定 时间采集血液、分离血清进行体外药理实 验，在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、 受体、基因等方面进行作用及机制研究。
血清经上述方法处理后，除去了大量固体成分 ，包括95%以上的蛋白质，80% 以上的糖，大部分 Ca2+、Mg2+等电解质。 未处理的血清1mL可形成70～80 mg冻干粉，处 理后1mL血清仅形成冻干粉5 mg 左右。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.4.3血清是否应该灭活
目前含药血清在采集后多经过56℃, 30min灭活处理。 血清灭活既可灭活掉血清中的部分补体,减弱对培 养细胞的非药物性影响，又减少微生物感染，符合常 规细胞培养要求。 但是灭活过程属于热处理范围,有可能丧失血清中一 部分热稳定性差的药物活性成分。更为重要的是经灭 活后，血清中的有效成分发挥药理效应的环境与体内 实验和临床产生药效的体内环境不相符。
一般认为以5%～20%的浓度较为适宜。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.7对照问题 4.7.1如何设立对照？ ★空白对照组(一般为生理盐水) ★空白血清对照组（加入于体外反应系统中 的质和量必须尽量同含药血清组一致） ★阳性药血清对照（无论是中药还是西药， 均应制成含药血清进行对照）。
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★含药血清与中药粗制品平行研究 ★离体试验和在体试验并行研究 ★血清药理学、药化学、药动学同步研究 ★正常动物、疾病动物含药血清对比研究
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4.8提倡血浆药理实验方法
①从胃肠吸收的中药有效成分是进入血浆,而非血清； ②凝血过程有一系列酶生成，可能降解某些中药成分; ③凝血酶刺激血小板与白细胞释放大量生物活性物质; ④凝血过程伴有纤溶、补体、激肽等系统活化; ⑤制备与灭活血清过程会导致中药成分损失； ⑥含药血浆与血清中药物浓度不尽相同； ⑦含药血清与血浆的活性也存在差异； ⑧含药血浆与血清的反应成分可能存在差别； ⑨含药血清与未含药血清不具可比性； ⑩血清预处理可能带来新的干扰。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.4.2预处理的方法
①丙酮法：向血清内加入3～4倍量丙酮，混匀，于 3000r/min离心，取上清液温水浴上蒸发，除去丙酮。
②乙醇法：向血清内加入3～4倍量95%乙醇，混匀，于 3000 r/min离心，取上清液温水浴上蒸发，除去乙醇。
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是否要造模？
血清供体动物最好造模，病理模型制备 的含药血清更能反映药物的真实疗效。
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4.2给药方案 4.2.1 给药剂量
★★增大给药剂量法： 参考公式，即给药剂量=在体试验的给药剂量×反应系统中被稀 释的倍数。 存在以下两个问题： (1)血药浓度并不能与给药剂量呈等倍数的提高。 (2)给药剂量可以提高的倍数受到灌胃药物浓度和体积的限制， 不可能达到公式所要求的量。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.5含药血清的保存
宜选用新鲜或保存时间较短的含药血清 进行实验，（4℃，3d以内）。
中药血清药理实验的几个关键技术 4.6血清添加量 应考虑血清本身所含物质及血清体积等 因素对体外试验结果的影响。浓度太低，血 清所含药物达不到有效含药量，浓度过高， 易产生 Nhomakorabea胞毒性作用。
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若干问题探讨
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研究背景
1987年，日本学者田代真一提出“血清药理学”的概念； 1990年，姜廷良教授在全国中医方剂研讨会上介绍了日本 有关中药血清药理学研究的动态和情况之后，国内中医领 域开展了相关的研究工作； 1992年，中药血清药理学的研究设立为国家中医药管理局 青年基金课题 1996年，中药血清药理学获得国家自然科学基金资助。