右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响

网络出版时间：2020 -8 -21 15 ：08 网络出版地址：htt p s ://kns . enki. netkems/detil/34. 1065. R. 20200820. 1449. 011. html
右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响
陈燕燕心，徐 魏'，向 力'，岳 静'，李兴元'，王 露'，郑 飞'，唐俊明3>4，郑 敏*
22020 -05 -06 接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：81670272）；湖北省科技厅重大
创新专项（编号：2018ACA162）;湖北医药学院创新团队 项目（编号:FDFR201601）;湖北医药学院生物医药研究院
PI 项目（编号:HBMUPL01807）
作者单位:1 4锦州医科大学湖北医药学院研究生培养基地，锦州
121001
2十堰市人民医院麻醉科（湖北医药学院附属人民医
院），十堰442000
3湖北医药学院附属十堰市人民医院临床医学研究所，十
442000
4湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰
442000
作者简介:陈燕燕，女，硕士研究生；
唐俊明，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail:Wn/jm416@ 163 - dm ；
郑 敏，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail ：lhj1286@163 .com
摘要 目的 观察右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增
殖、分化的影响，探究心力衰竭患者骨骼肌病的发病机制。

方法 用免疫组化分析C2C12细胞肾上腺素能受体的表达
特征。

将C2C12细胞分为6组:对照组和右美托咪定5个浓
度梯度组（5、10、20、40、80 mmol/L ）。

CCK-8法检测右美托
咪定对C2C12细胞增殖的影响。

用分化培养基诱导C2C12 分化，按单次和连续单次的给药方式给C2C12细胞加药，分
化6 d 后，用免疫荧光检测不同分组肌球蛋白重链（MYH ）、 肌细胞增强因子2C （ MEF2C ）、肌细胞生成蛋白# MyoG ）的表 达水平，并定量分析C2C12细胞分化、融合为含不同细胞核
数的肌管数。

将C2C12细胞分为2组:对照组和右美托咪定
（20 mmol/L ）组,按连续单次的给药方式加药，用免疫荧光
检测C2C12细胞分化第2、4、6天的MYH 、MEF2C 、MyoG 表 达水平。

结果C2C12细胞呈现出！2-肾上腺素能受体表达
的特征。

CCK-J 法显示右美托咪定抑制C2C12细胞的增殖 （P <0. 05），并呈浓度依赖性。

单次给药没有连续单次给药
抑制C2C12细胞分化的效应明显，且连续单次给药随着浓 度的增加，MYH 、MEF2C 、MyoG 的表达水平逐渐降低，
C2C12细胞分化为含多细胞核数的肌管逐渐减少（P <
0.05）。

C2C12细胞分化第2、4、6天，右美托咪定（20 mmol/L
组）的MYH 、MEF2C 、MyoG 的表达水平均比对照组低。

结论
小鼠成肌细胞C2C12上存在！2肾上腺素能受体,右美托
咪定可能通过与！2肾上腺素能受体结合抑制C2C12细胞 的增殖、分化，且与MEF2C 、MyoG 表达水平降低密切相关。

关键词右美托咪定；交感神经过度激活；骨骼肌萎缩;
C2C12细胞;增殖;分化
中图分类号R 365
文献标志码A 文章编号1000 -1492（2020）09 -1374 -07
doi ： 10. 19405/j. enki. issn1000 - 1492. 2020. 09. 011
心力衰竭是一种预后不良的临床综合征，其特
征是运动不耐受、早期疲劳和与萎缩相关的骨骼肌
病［1］，骨骼肌病是心力衰竭患者运动能力受限的主
要决定因素［2］。

长期以来交感神经系统的激活和
副交感神经系统的抑制被认为是心力衰竭临床综合 征的表现［3］。

有研究⑴表明交感神经长期过度激
活会导致心力衰竭患者诱发骨骼肌病，但相关机制
知之甚少。

课题组之前已证实异丙肾上腺素的持续
刺激通过激活"1受体并失活"2受体抑制小鼠成 肌细胞C2C12的分化、融合和肌管形成⑷，但是否 !受体也参与了交感神经长期过度激活诱发骨骼肌
病的病理过程，未有研究涉及。

该研究应用选择性 !受体激动剂一右美托咪定刺激C2C12细胞，来
揭示交感神经长期过度激活与C2C12细胞增殖、分 化和肌 形 的 。

1材料与方法
1.1材料C2C12成肌细胞系（简称C2C12细胞） 购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清购自杭州四
季青生物工程材料有限公司;马血清购自美国GRd
公司；0. 25%胰蛋白酶购自武汉安特捷生物技术有
限公司;荧光倒置显微镜购自日本尼康公司；高糖
DMEM 购自美国Gibco 公司。

1.2方法
1.2.1 CCIK8法检测右美托咪定对C2C12细胞增 殖的影响 取1 ml 待传代的C2C12细胞悬液接种
于75 cm 2的培养皿中,加入含10%胎牛血清的高糖
培养基（增殖培养基），调整细胞密度为1 x105/ml ，
C2C12 细胞接种 4
96
， 96
接种30个孔，每孔接种100 #细胞悬液,将全部96
孔板置于37C 、5% CO 2、饱和湿度细胞培养箱中培
养。

待C2C12细胞增殖培养24h后,将增殖培养基血清高糖培养基，培养24h o96孔的30分6分组，每组5个复孔,6分组分对照组（右美托咪定0mmo/L）和右美托咪定5组（5、10、20、40、80 mmo/L）°将无血清高糖培养基换成增殖培养基,并按分组分同的右美托咪定,496分别培养12$24$48$72h后，向10# CCK-8,置培养箱中培养0.5h,然后用酶标仪测定细胞在450nm处的°
1.2.2C2C12细胞分化体系的建立C2C12细胞常规复苏并接种于75cm2的培养皿中，培养条件10%胎牛血清的高糖DMEM培养基（培养基），置于37b、5%CO2、饱和细胞培养箱中培养。

细胞增殖融合达80%〜90%时，按1：3传代,传代的C2C12细胞按上述条件继续培养，以备后续实验用。

C2C12细胞在增殖培养基中培养，待细胞融合至70%时，换用含2%马血清的高糖DMEM培养基（分化培养基）诱导C2C12细胞分化。

每隔1d1分化培养基，同时每天微镜下观察细胞的分化°
1.2.3实验分组及给药方式
1.2.3.1分组右美托咪定分成6组：对照组（0mmo/L）,组（5、10、20、40、80 mmo/L）°单次给药和连续单次给药均按这6组浓度梯度给药°
1.2.3.2右美托咪定的给单次给药:在增殖培养基中C2C12细胞增殖融合至70%时，换成分化培养基诱导C2C12细胞分化，此时加入右美托定，随后右美托咪定，并隔1d分化培养基；连培养6d°连单次给药：笔
培养基中C2C12细胞增殖融合至70%时，换成分化培养基诱导C2C12细胞分化，此时右美托咪定，随后天右美托咪定，并隔1d分化
培养基，连培养6d°
1.2.4细胞免疫荧光化学检测C2C12细胞按每孔1.25h104/ml密度接种于24,细胞贴并融合至70%时，分化培养基诱导C2C12细胞分化，按上述实验分组分别单次给药和连续单次给药，连培养6d,然后弃分化培养基,1 X PBS连3次,4%的多聚甲醛固定15min,再用1hPBS3,5min,然后用5%的山羊血清和0.3%TXmn X-100室1h°后的细胞分别加入抗体稀释释的肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MYH）（货号：sc-376157，抗体释：1:100，美国Santa Cruzo公司），肌细胞增强因子2C（myocytc enhancer factor2C, MEF2C）（货号:#5030，抗体稀释：1:400,美国Cell Signaling Techno/yy公司）,肌细胞生成蛋白（myo-genin,MyoG）（货号：sc-12732,体释：1:50,美国Santa Cruzo公司），其中MYH和MEF2C加入同一孔中，双，MyoG同，进行单染，将24放4b冰箱°然后用1xPBS3次，5min,了MYH 和MEF2C荧光一抗的孔中加入抗兔的荧光二抗（1：300）,了MyoG的一抗的
鼠的（1:300）,室1h,用1h PBS3次，5min,后DAPI200 #/避室温15min,用1hPBS3遍, 5min,然后在倒置微镜下观察并摄片。

1.3统计学处理采用SPSS17.0分，
资料以2±i表示，多组间比较采用单因素方差分析（O/uway ANOVA）,组间比较采用方检°P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1$肾上腺素能受体在C2C12细胞的表达特征免疫荧光结果显示，在C2C12细胞的增殖、分化阶段呈现出!素能受体阳性的特征（图1）°
图1$肾上腺素能受体在增殖和分化C2C12细胞的表达特征x200
A：增殖阶段；B：分化阶段
2.2右美托咪定对C2C12细胞增殖的影响CCK-8结果显示，第12、24、48、72h分组中，与对照组相比,除第12h分组中，只右美托咪定（40、80mmo/L）两个高浓度组呈抑制C2C12细胞增殖外，其他3个分组，不同的右美托咪定均C2C12细胞的增,的，抑制作用（图2）°
2.3C2C12细胞分化体系的建立C2C12细胞经
后接种75cm2的培养皿,倒置微镜下观察,细胞贴壁铺开后多形突起
,
0.8
0.0
0.6
亠
0.4
0.2
匚二|12h □ 24h 匚二I48h
72 h
0 5 10 20 40 80 0 5 10 20 40 80 0 5 10 20 40 80 0 5 10 20 40 80
右美托咪定(mmol/L)
图2 CCK-8法检测不同浓度右美托咪定对C2C12细胞增殖的影响
与对照组比较：# P<0. 05
核为椭圆形，单核，核仁明显。

待细胞增殖至70%
时，更换为分化培养基诱导C2C12细胞分化。

分化
的细胞 多核、串珠样 ，并形成肌管。

第0、2、4、6天 , 时间的推移肌管细胞核融合数
目逐渐增多， 分化第6天达到高峰（图3 ）。

图3光镜下C2C12细胞分化的时间窗 X100
A ：第0天；
B ：第2天；
C ：第4天；
D ：第6天
2.4不同给药方式下，右美托咪定对C2C12细胞 分化的影响免疫 结 示，不论单次给药还连续单次给药，与对照组
，右美托咪定均
抑制肌管形成（MYH ）和MEF2C 、MyoG 表达的现
，连单次给药组抑制肌管形成（MYH ）和MEF2C 、MyoG 表达的作用比单次给药组显著（图4、
5、6）。

肌管分成细胞核融合数目为3 ~5、5 ~10、
>10的3 同分组，显示较高浓度组（20、40、
80 mmol/L 组），连 单次给
肌管形成的作用
强于单次给药，3 肌细胞核融合数目分组均抑
制，而单 给
细胞核融合数目>10组 作
用差 统计学意义。

，肌细胞核融合的3
个分组中，右美托咪定（80 mmol/L ）组与对照组相
，单给药组：F = 1.30，P < 0. 05 ； F = 2. 26，P < 0.5 ； F = 8.55，P < 0. 05 ；连续单次给药组：F =
25. 83，P<0. 05 ； F = 9.00，P < 0. 05 ； F = 1. 45，P < 0. 05 （图 4、5 ）o
2.5 分化时间，右美托咪定对C2C12细胞分
化的影响免疫 结 示，右美托咪定（20
mmol/L ）组与对照组相比，在C2C12细胞分化的第
2、4、6天均
右美托咪定抑制肌管形成（MYH ）
和MEF2C 、MyoG 表达的现象，且随时间的延长，抑
作用
（图7）。

3讨论
本研究利用国内外通用的C2C12细胞作为研
究对象，用免疫 的 了 C2C12细胞
、分化阶段均有«2受体的表达，提示
［神
分泌的儿茶酚胺
与骨骼肌上的
!受体结合而发挥作用。

阶段，用CCKO
法证实了右美托咪定在C2C12细胞 的第12
、
^
1
駅
親
滋
讯
*
根
阳
靛
总
<
MYH MEF2C DAPI Merge
BBS
B
单次给予右美托咪定(mmol/L)
图4单次给予不同浓度右美托咪定对C2C12细胞分化、融合为多细胞核的肌管数和MEF2C表达的影响h200 A：单次给不同浓度右美托咪定逐渐抑制C2C12细胞分化的肌管形成(MYH)和MEF2C表达的免疫荧光细胞化学染色；B〜D：单次给不同浓度右美托咪定对C2C12细胞分化为含有不同数目细胞核的肌管数的影响;绿色:MYH阳性;红色:MEF2C阳性;蓝色:DAPI染的细胞核;与对照组比较：#P<0-05
24$48$72h均，，说明交感神经过度激活可能通过抑制成肌细胞的增殖而导致骨骼肌萎缩。

在分化阶段，利用C2C12细胞建立了骨骼肌细胞的分化体系，免疫结连单次给药，与对照组，不同右美托咪定均抑制C2C12的分化和肌管的形成，且随着浓度的增，作用；而单给药，高组,的作用。

连单次给药组, C2C12细胞分化进而导致多细胞融合形成肌管的能的逐渐降低，这与临床
造成骨骼肌的表现一致。

所以连续单次给予右美托咪定建立模拟机体
造成骨骼肌的模型更接近，
意义。

骨骼肌再生是一个高度复杂的过程，是由肌肉特异性调节转录因子(myogenic mgu/tom factor/，MX)家族和MEF2家族共同参与的M/s家族包括肌分化(MyoD)、MyoG、肌源性因子5 (Myf5)和肌源性调节因子4(M/4)；MEF2家族包括MEF2A、-B、-C and氢，这两类转录因子直接相互作用，为骨肌基因的建立了的转录密码⑷。

MyoG的表达发生在肌管形成开始时,是导致C2C12细胞融合的关键因素［7］;而激活的MEF2C诱导并加强C2C12细胞的分化［6,8］。

本研究同时分析了右美托咪定对C2C12细胞分化过程中MyoG和MEF2C表达的影响。

结果发现右美托咪定抑制MEF2C和MyoG表达的作用与抑制C2C12细胞分化、融合及肌管形成(MYH)和的作用相一致，同样具，同样是连续单次给单次给作用，
提示右美托咪定抑
(T /I o l
C
连续单次给予右美托咪定(mmol/L)
5＜肌管核融合数＜10
0 5 10 20 40 80
连续单次给予右美托咪定(mmol/L)D
5「 肌管核数＞10
*
连续单次给予右美托咪定(mmol/L)
图5连续单次给予不同浓度右美托咪定对C2C12细胞分化、融合为多细胞核的肌管数和MEF2C 表达的影响 x 200
A ：连续单次给不同浓度右美托咪定逐渐抑制C2C12细胞分化的肌管形成(MYH )和MEF2C 表达的免疫荧光细胞化学染色;
B 〜D ：连续单 次给不同浓度右美托咪定对C2C12细胞分化为含有不同数目细胞核的肌管数的影响;绿色:MYH 阳性；红色:MEF2
C 阳性;蓝色:DAPI 染的细 胞核;与对照组比较：# P＜0. 05
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图6单次和连续单次给予不同浓度右美托咪定对C2C12细胞分化的MyoG 表达的影响 x 200
A ：单次给不同浓度右美托咪定逐渐抑制C2C12细胞分化的MyoG 表达的免疫荧光细胞化学染色；
B ：连续单次给不同浓度右美托咪定逐 渐抑制C2C12细胞分化的MyoG 表达的免疫荧光细胞化学染色;绿色:MyoG 阳性;蓝色:DAPI 染的细胞
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图7连续单次给予右美托咪定（20mmol/L）时间依赖性抑制C2C12细胞分化、融合、肌管形成和MEF2C、MyoG的表达h200 A：用免疫荧光染色法检测不给予或连续单次给予右美托咪定（20mmo/L）后C2C12细胞分化第2、4、6天的肌管形成（MYH）和MEF2C表达;绿色:MYH阳性;红色:MEF2C阳性；蓝色:DAPI染的细胞核；B:用免疫荧光染色法检测不给予或连续单次给予右美托咪定（20 mmo/L）后C2C12细胞分化第2、4、6天的MyoG表达;绿色:MyoG阳性;蓝色:DAPI染的细胞核
制肌管形成（MYH）与抑制MEF2C、MyoG的表达有
由于连续单次给药组的右美托咪定（20mmo/L）抑制C2C12细胞的肌管形成，但不影响C2C12细胞的，故利用免疫分别测定对照组和连续单次给药的右美托咪定（20mmo/L）组中C2C12细胞分化第2、4、6天的肌管形成情况和MEF2C、MyoG 的表达，结 示，与对照组，右美托咪定（20mmo/L）组抑制C2C12细胞分化第2、4、6天的肌管形成（MYH）和MEF2C、MyoG的表达，且随着时间的，作用，一步了右美托咪定对C2C12细胞从分化到肌管形成的整个程均作用。

综上，本研究首次证实了C2C12细胞在增殖、分化阶段均有!受体的表达,且右美托咪定
通过与C2C12细胞上的a2受体结合而抑制C2C12细胞的增殖、分化和肌管形成，而MEF2C和MyoG 表达的变化特征说明右美托咪定通过抑制MEF2C 和MyoG的表达而抑制C2C12细胞的分化和肌管形成，但右美托咪定对C2C12细胞抑制作用的具体分子机本研究中并及，一步探究。

本研究了者
导致的骨骼肌及的新机制，骨肌病的发病机制提供了实验依据。

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-
Effects of dexmedetomidine on proliferation and
differentiation of mouse myoblasts C2C12
Chen Yanyan1，2",Xu We/,Xiang Li3,et al
(1GraPuate Training Base of Hubet Uni'vefnh of MePicine,J inzhou MePnal Unnersny,Jinzhou121001;
2Dept of Anesthesiology,Shiyan Renmiv Hospital(Renmiv Hospital AffiliateP t Hubet UnwersPh of Medicine),Shiyan442000;3Institute g CUnVal MePicine,Shiyan Renmiv Hospital,
Hubet UnwefPh o/MePicine,Shiyan442000)
Abstract Objective To explore the pathogenesis of skeletal myopathy in patients with hex/failure by obse/ing the effects of dexmedetomidine on the proliferation and dRferentiation of mouse myoblast C2C12-Methods Immu-nohistchemist/was used to analyze the expression chewctWs/cs of adrenergic receptors in C2C12cells.C2C12 cells were divided into6g/ups:the control g/up and dexmedetomidine5concentration gradient g/ups(5,10, 20,40,80mmol//)-CCK-8method was used to detect the effect of dexmedetomidine on C2C12ce/s p/liRm-tion.DiRe/ntimion medium was used to induce the dRferentiation of C2C12cells,and C2C12col l were dosed with single or continuous single administration.After6d of coll dRferentiation,the expression levels of myosin heave chain#MYH),myocyte enhancer Vyctor2C(MEF2C)and myoyenin(MyoG)in diRe/nt g/ups were detected by immunofluorescence,and the number of myotubas containing diRe/nt nuclei of C2C12cells was quantitatively ana­lyzed.C2C12calls were divided into two g/ups:the control g/up and dexmedetomidine g/up(20mmol//)-Then C2C12cells were dosed with continuous single administration and the expression levels of MYH,MEF2C and MyoG of dRferentiated C2C12cells on the2nd,4th and6th day in diRe/nt g/ups were detected by immunoOuo-msdnca.Results C2C12cells exhibited the characteristics of a2-adrenergic receptor K-8esay showed that dexmedetomidine inhibited the proliferation of C2C12cells in a concenWation-dependent manner(P< 0.05)-The effect of single adminRtration of dexmetomidina on the dRferentiation of C2C12cells was less significant than the effect of the continuous single administration of dexmetomidina,and with the increase of concentration in the continuous single administration of dexmetomidina g/ups,the expression levels of MYH,MEF2C,MyoG grad-uW l y decreased,the number of C2C12cells dRferentiated into myotubas with multiple cal l nuclei gmduW l y de­creased(P<0.05)-On the2nd,4th and6th day after dRferentiation of C2C12cells,the expression levels of MYH,MEF2C,MyoG in the20mmol//gmup were all lower than those in the control g/up-Conclusion!2ad­renergic receptors exists in mouse myoblast C2C12-Dexmetomida may inhibit the p/liRration and dRferentiation of C2C12cells by binding to!2adrenergic receptors,which is closely related to the decrease of the MEF2C and MyoG expression levels-
Key worEs dexmedeWmidina；sympathetic overactivation；skeletal muscle atrophy；C2C12colls;proliferation；dRferentiation。