丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较_盛萍萍
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Methodological comparison of observation and colonization measurement of arbuscular mycorrhizal fungi
SHENG Ping-Ping LIU Run-Jin LI Min*
Institute of Mycorrhizal Biotechnology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
为寻找有毒染料的替代品，人们曾尝试过多种 染色方法。Vierheilig et al.（1998）最终建立了醋酸 墨水染色法。将根样置于加入了家用纯白醋的 5% 醋酸墨水溶液中煮 3min，以清水或白醋清洗，脱色 后的根样可室温保存于自来水中。通过用不同公司 生产的紫色、红色、绿色、蓝色和黑色墨水对比发 现，以 Shaeffer 公司生产的黑色墨水染色效果最佳。
521
1.3 氯唑黑 E 染色特点 基于上述两种方法的缺陷，Brundrett et al.
（1984）建立了氯唑黑 E 染色法。该法将经 KOH 处理的根系置于等体积的 85%乳酸、甘油和水溶解 的 0.1%（w/v）氯唑黑 E 混合溶液中 90℃下浸泡 1h 以上，甘油脱色。镜检时用 2%三氯甲醛作浮载 剂。该法清晰度高、反差大，丛枝结构清晰，但氯 唑黑 E 被认为是致癌疑似物（Vierheilig et al. 1998） 而存在不足。 1.4 醋酸墨水染色特点
基金项目：国家自然科学基金（No. 30871737）；“十二五”国家科技支撑项目“北方设施蔬菜高效节能生产关键技术研究与集成”（No. 2011BAD12B03）； 青岛市自然科学基金（No. 08-1-3-20-jch） *Corresponding author. E-mail: minli@ 收稿日期: 2011-03-26, 接受日期: 2011-04-28
1 AM 染色方法的比较
AM 形态结构观察主要采用染色镜检法，通常 需要根系透明-染色-分色 3 个过程，其中最重要的 步骤是染色。观察 AM 生长状况的染色方法有多种，
笔者采用文献计量方法对所获资料（web of science 系统，查阅了最近 20 年有关 AM 的文献）进行统 计，分析了国内外研究者采用的染色方法。结果表 明，采用最多的是台盼蓝染色法，其次是酸性品红 染色法（表 1）。 1.1 台盼蓝（曲利苯蓝）染色特点
Abstract: Observation of arbuscular mycorrhizal (AM) colonization status and measurement of colonization percentage is an important fundamental work in mycorrhizal research. Methods for root staining and quantifying AM colonization percentage is reviewed, compared and evaluated in this paper. Ink-vinegar staining method observing colonization status, root-segment colonization weighting method, and magnified intersections method measuring colonization percentage, are considered to be appropriate approaches in AM studies with greater scientific, accurate and feasible values when compared with other methods. Different observation methods can be used for different purposes. For example, magnified intersection method could be chosen to observe and measure the arbuscule development status of AM fungi, whilst direct counting method could be employed to count the
表 1 几种主要丛枝菌根染色观察方法的应用比例
Table 1 Proportion of several main staining methods used for AM fungal colonization
采用时间
台盼蓝
酸性品红
氯咄黑 E
醋酸墨水
亚甲蓝
番红
ห้องสมุดไป่ตู้
Time (year) 1991－2000 2001－2010
520
Mycosystema
numbers of vesicles and entry points per unit root length. Thus the research results obtained for specific purposes are comparable. It is necessary to establish molecular techniques and fatty acid quantitative method to measure colonization status of one or more species of AM fungi, which will promote studies in physiological and ecological function. Key words: arbuscular mycorrhizal fungi, staining methods, colonization percentage, mycorrhizal development, molecular techniques
除了以上几种方法外，还有其他一些染色剂同 样可以用作 AM 真菌侵染状况观察研究，如苯胺蓝、 棉蓝、甲基蓝、亚甲蓝、番红（Grace & Stribley 1991） 等，各自具有一定的优点。如苯胺蓝和甲基蓝毒性 较小等。但由于染色清晰度与反差效果不够理想而 不被广泛应用。
染色剂染色效果直接影响到试验结果的准确 性（Brundrett et al. 1996；Widden 2001），故本文针 对清晰度、反差效果、染色时间、褪色时间、毒性、 成本等方面对几种常用染色方法进行了比较（表 2）。
该法由 Kormanik et al.（1980）发表，将根段 或经过 FAA 固定的根系经 KOH 透明、乳酸或 2% HCl 酸化后置于 90℃的酸性品红乳酸甘油染色液染 色 20－60min，或室温下过夜，乳酸分色，镜检。 酸性品红染色液可回收重复使用。该法操作简便、 染色效果可靠稳定，然而由于根皮层也被染上相同 或略浅的颜色，导致颜色反差不明显。
菌根学是一门新兴的边缘学科，其理论和研究 方法等方面已独具特色。由于几乎所有丛枝菌根 （arbuscular mycorrhiza，AM）真菌接种试验均会 涉及到菌根发育状况观察与侵染率测定，因此半个 多世纪以来人们十分重视其观察与测定方法研究， 相继建立了台盼蓝染色法和酸性品红染色法来观 察 AM 的发育状况，并发展了测定 AM 真菌侵染率 的多 种方 法（ Hepper 1977 ； Bethlenfalvay et al. 1981）。McGonigle et al.（1990）曾将肉眼观察测定 AM 真菌侵染根系长度比率的方法分成 3 组，即主 观估计法、计算被侵染根段或具有侵染的显微镜观 察视野百分数法和格线交叉法。虽然 AM 侵染状况 观察测定方法较多，但良莠不齐；更重要的是由于 研究者所采用的方法不同，其研究结果也缺乏可比 性。这在很大程度上限制了菌根学的发展与应用。 因此，有必要对这些方法进行评价，以确定无毒可 靠、省时省力、快速准确、方便易行的实用技术， 从而以更加科学化、标准化的方法测定 AM 侵染状 况，加快推动该领域研究。
2 AM 侵染率测定方法的比较
文献报道中主要以格线交叉法、根段侵染率加 权法、放大交叉法、侵染分级强度法等测定 AM 真 菌侵染率，表 3 给出国内外近 20 年报道文献中所 采用的方法。统计结果表明，1991－2000 年间以格
染色剂 Dye
酸性品红 Acid fuchsin
表 2 几种常见的丛枝菌根染色方法比较
60min），70%乙醇脱色 5min，暗隔内生菌（DSE） 的透明菌丝内所积聚的脂类颗粒被 SudanIV 染上鲜 红色，复式显微镜下能够观察到此类透明菌丝在根 皮层组织内的存在状况。该技术操作简便、毒性小、 成本低、染色效果极佳，适用于野生和栽培草本植 物 AM 的染色和制片观察。 1.5 其他染色法
Table 2 Comparison of several methods to stain AM roots
染色效果 反差效果 酸化
盛萍萍 刘润进 李敏*
青岛农业大学菌根生物技术研究所 青岛 266109
摘 要：菌根生长状况观察与侵染率测定是菌根学研究中一项重要的基础性工作。综述了丛枝菌根（AM）染色观察与侵染 率测定方法研究概况，并对其进行比较和评价。认为采用醋酸墨水染色观察 AM 生长状况与采用根段侵染率加权法和放大 交叉法测定 AM 真菌侵染率是目前较为科学、准确、易行的方法。根据不同需要也可选择其他适宜的方法，如要了解丛枝 发育状况，可采用放大交叉法；如要了解泡囊和侵入点数量，可采用直接计数法，从而使其研究结果具有可比性。有必要建 立基于分子生物学技术和脂肪酸定量分析技术测定一种或数种 AM 真菌侵染状况，这将有力推动 AM 真菌生理、生态功能 研究的发展。 关键词：丛枝菌根真菌，染色方法，侵染率，菌根发育，分子技术
Trypan blue 77% 60%
Acid fuchsin 13% 17%
Chlorazol black E 7% 7%
Ink and vinegar 0 10%
Methylene-blue 0 3%
Safranine 3% 3%
/jwxtcn
Vol.30 No.4
Phillips & Hayman（1970）首次将台盼蓝染色 法应用于 AM 观察和侵染率的测定。根系用碱液透 明并酸化后，放到沸腾的乳酚台盼蓝（0.05%）溶 液中染色 3min，或 90℃下染色 10－30min，乳酚溶 液脱色，镜检。由于染色过程中使用腐蚀性试剂， 染色和褪色需要在通风橱中进行。为减少毒性， Koske & Gemma（1989）改进了台盼蓝染色法，以 无毒的酸性甘油代替乳酸和苯酚。该法染色效果可 靠稳定，但根皮层也被染上相同或略浅的颜色，AM 真菌与根皮层组织之间颜色反差小，且毒性较大。 1.2 酸性品红染色特点
Mycosystema
菌 物 学 报 15 July 2011, 30(4): 519-525
jwxt@ ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.
丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较
放大交叉法测定am真菌侵染率减少了其他方法中由于人为主观因素造成差异并且在200倍显微镜下观察更加清晰准确此法为am真菌侵染率测定的研究作出了很有意义的改进但笔者并不认同其用丛枝丰度来代替am真菌侵染率的观点该测定方法下用丛枝泡囊菌丝三者共同侵染状况来作为判断am真菌侵染情况的依据可能会更加准确
DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.04.002
在此基础上，杨亚宁等（2010）进一步发展了 这一染色法：将根样经 20% KOH 透明、酸化（5% 醋酸）后，用 5%醋酸墨水染色液（派克纯黑书写 墨水 Quink）染色，清水浸泡脱色后即可镜检。丛 枝结构清晰可见，并能分辨 AM 真菌与其他未知真 菌。此外，Quink 初染后，再经过 SudanIV 复染（60℃、
SHENG Ping-Ping LIU Run-Jin LI Min*
Institute of Mycorrhizal Biotechnology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
为寻找有毒染料的替代品，人们曾尝试过多种 染色方法。Vierheilig et al.（1998）最终建立了醋酸 墨水染色法。将根样置于加入了家用纯白醋的 5% 醋酸墨水溶液中煮 3min，以清水或白醋清洗，脱色 后的根样可室温保存于自来水中。通过用不同公司 生产的紫色、红色、绿色、蓝色和黑色墨水对比发 现，以 Shaeffer 公司生产的黑色墨水染色效果最佳。
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1.3 氯唑黑 E 染色特点 基于上述两种方法的缺陷，Brundrett et al.
（1984）建立了氯唑黑 E 染色法。该法将经 KOH 处理的根系置于等体积的 85%乳酸、甘油和水溶解 的 0.1%（w/v）氯唑黑 E 混合溶液中 90℃下浸泡 1h 以上，甘油脱色。镜检时用 2%三氯甲醛作浮载 剂。该法清晰度高、反差大，丛枝结构清晰，但氯 唑黑 E 被认为是致癌疑似物（Vierheilig et al. 1998） 而存在不足。 1.4 醋酸墨水染色特点
基金项目：国家自然科学基金（No. 30871737）；“十二五”国家科技支撑项目“北方设施蔬菜高效节能生产关键技术研究与集成”（No. 2011BAD12B03）； 青岛市自然科学基金（No. 08-1-3-20-jch） *Corresponding author. E-mail: minli@ 收稿日期: 2011-03-26, 接受日期: 2011-04-28
1 AM 染色方法的比较
AM 形态结构观察主要采用染色镜检法，通常 需要根系透明-染色-分色 3 个过程，其中最重要的 步骤是染色。观察 AM 生长状况的染色方法有多种，
笔者采用文献计量方法对所获资料（web of science 系统，查阅了最近 20 年有关 AM 的文献）进行统 计，分析了国内外研究者采用的染色方法。结果表 明，采用最多的是台盼蓝染色法，其次是酸性品红 染色法（表 1）。 1.1 台盼蓝（曲利苯蓝）染色特点
Abstract: Observation of arbuscular mycorrhizal (AM) colonization status and measurement of colonization percentage is an important fundamental work in mycorrhizal research. Methods for root staining and quantifying AM colonization percentage is reviewed, compared and evaluated in this paper. Ink-vinegar staining method observing colonization status, root-segment colonization weighting method, and magnified intersections method measuring colonization percentage, are considered to be appropriate approaches in AM studies with greater scientific, accurate and feasible values when compared with other methods. Different observation methods can be used for different purposes. For example, magnified intersection method could be chosen to observe and measure the arbuscule development status of AM fungi, whilst direct counting method could be employed to count the
表 1 几种主要丛枝菌根染色观察方法的应用比例
Table 1 Proportion of several main staining methods used for AM fungal colonization
采用时间
台盼蓝
酸性品红
氯咄黑 E
醋酸墨水
亚甲蓝
番红
ห้องสมุดไป่ตู้
Time (year) 1991－2000 2001－2010
520
Mycosystema
numbers of vesicles and entry points per unit root length. Thus the research results obtained for specific purposes are comparable. It is necessary to establish molecular techniques and fatty acid quantitative method to measure colonization status of one or more species of AM fungi, which will promote studies in physiological and ecological function. Key words: arbuscular mycorrhizal fungi, staining methods, colonization percentage, mycorrhizal development, molecular techniques
除了以上几种方法外，还有其他一些染色剂同 样可以用作 AM 真菌侵染状况观察研究，如苯胺蓝、 棉蓝、甲基蓝、亚甲蓝、番红（Grace & Stribley 1991） 等，各自具有一定的优点。如苯胺蓝和甲基蓝毒性 较小等。但由于染色清晰度与反差效果不够理想而 不被广泛应用。
染色剂染色效果直接影响到试验结果的准确 性（Brundrett et al. 1996；Widden 2001），故本文针 对清晰度、反差效果、染色时间、褪色时间、毒性、 成本等方面对几种常用染色方法进行了比较（表 2）。
该法由 Kormanik et al.（1980）发表，将根段 或经过 FAA 固定的根系经 KOH 透明、乳酸或 2% HCl 酸化后置于 90℃的酸性品红乳酸甘油染色液染 色 20－60min，或室温下过夜，乳酸分色，镜检。 酸性品红染色液可回收重复使用。该法操作简便、 染色效果可靠稳定，然而由于根皮层也被染上相同 或略浅的颜色，导致颜色反差不明显。
菌根学是一门新兴的边缘学科，其理论和研究 方法等方面已独具特色。由于几乎所有丛枝菌根 （arbuscular mycorrhiza，AM）真菌接种试验均会 涉及到菌根发育状况观察与侵染率测定，因此半个 多世纪以来人们十分重视其观察与测定方法研究， 相继建立了台盼蓝染色法和酸性品红染色法来观 察 AM 的发育状况，并发展了测定 AM 真菌侵染率 的多 种方 法（ Hepper 1977 ； Bethlenfalvay et al. 1981）。McGonigle et al.（1990）曾将肉眼观察测定 AM 真菌侵染根系长度比率的方法分成 3 组，即主 观估计法、计算被侵染根段或具有侵染的显微镜观 察视野百分数法和格线交叉法。虽然 AM 侵染状况 观察测定方法较多，但良莠不齐；更重要的是由于 研究者所采用的方法不同，其研究结果也缺乏可比 性。这在很大程度上限制了菌根学的发展与应用。 因此，有必要对这些方法进行评价，以确定无毒可 靠、省时省力、快速准确、方便易行的实用技术， 从而以更加科学化、标准化的方法测定 AM 侵染状 况，加快推动该领域研究。
2 AM 侵染率测定方法的比较
文献报道中主要以格线交叉法、根段侵染率加 权法、放大交叉法、侵染分级强度法等测定 AM 真 菌侵染率，表 3 给出国内外近 20 年报道文献中所 采用的方法。统计结果表明，1991－2000 年间以格
染色剂 Dye
酸性品红 Acid fuchsin
表 2 几种常见的丛枝菌根染色方法比较
60min），70%乙醇脱色 5min，暗隔内生菌（DSE） 的透明菌丝内所积聚的脂类颗粒被 SudanIV 染上鲜 红色，复式显微镜下能够观察到此类透明菌丝在根 皮层组织内的存在状况。该技术操作简便、毒性小、 成本低、染色效果极佳，适用于野生和栽培草本植 物 AM 的染色和制片观察。 1.5 其他染色法
Table 2 Comparison of several methods to stain AM roots
染色效果 反差效果 酸化
盛萍萍 刘润进 李敏*
青岛农业大学菌根生物技术研究所 青岛 266109
摘 要：菌根生长状况观察与侵染率测定是菌根学研究中一项重要的基础性工作。综述了丛枝菌根（AM）染色观察与侵染 率测定方法研究概况，并对其进行比较和评价。认为采用醋酸墨水染色观察 AM 生长状况与采用根段侵染率加权法和放大 交叉法测定 AM 真菌侵染率是目前较为科学、准确、易行的方法。根据不同需要也可选择其他适宜的方法，如要了解丛枝 发育状况，可采用放大交叉法；如要了解泡囊和侵入点数量，可采用直接计数法，从而使其研究结果具有可比性。有必要建 立基于分子生物学技术和脂肪酸定量分析技术测定一种或数种 AM 真菌侵染状况，这将有力推动 AM 真菌生理、生态功能 研究的发展。 关键词：丛枝菌根真菌，染色方法，侵染率，菌根发育，分子技术
Trypan blue 77% 60%
Acid fuchsin 13% 17%
Chlorazol black E 7% 7%
Ink and vinegar 0 10%
Methylene-blue 0 3%
Safranine 3% 3%
/jwxtcn
Vol.30 No.4
Phillips & Hayman（1970）首次将台盼蓝染色 法应用于 AM 观察和侵染率的测定。根系用碱液透 明并酸化后，放到沸腾的乳酚台盼蓝（0.05%）溶 液中染色 3min，或 90℃下染色 10－30min，乳酚溶 液脱色，镜检。由于染色过程中使用腐蚀性试剂， 染色和褪色需要在通风橱中进行。为减少毒性， Koske & Gemma（1989）改进了台盼蓝染色法，以 无毒的酸性甘油代替乳酸和苯酚。该法染色效果可 靠稳定，但根皮层也被染上相同或略浅的颜色，AM 真菌与根皮层组织之间颜色反差小，且毒性较大。 1.2 酸性品红染色特点
Mycosystema
菌 物 学 报 15 July 2011, 30(4): 519-525
jwxt@ ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.
丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较
放大交叉法测定am真菌侵染率减少了其他方法中由于人为主观因素造成差异并且在200倍显微镜下观察更加清晰准确此法为am真菌侵染率测定的研究作出了很有意义的改进但笔者并不认同其用丛枝丰度来代替am真菌侵染率的观点该测定方法下用丛枝泡囊菌丝三者共同侵染状况来作为判断am真菌侵染情况的依据可能会更加准确
DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.04.002
在此基础上，杨亚宁等（2010）进一步发展了 这一染色法：将根样经 20% KOH 透明、酸化（5% 醋酸）后，用 5%醋酸墨水染色液（派克纯黑书写 墨水 Quink）染色，清水浸泡脱色后即可镜检。丛 枝结构清晰可见，并能分辨 AM 真菌与其他未知真 菌。此外，Quink 初染后，再经过 SudanIV 复染（60℃、