灭活剂保护剂和免疫佐剂

A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
取氢氧化铝干粉50～55kg, 加 入6万毫升沸水中, 搅拌均匀; 倒入硫酸100kg, 爆沸至棕褐 色, 经30～60min后, 加温水, 边加边搅拌约至总量为35万 毫升；用前加水稀释至100万 毫升, 温度约为80℃, 盛装在 一个缸内
并发挥免疫系统细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞, T细胞与B细胞）。
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作用机理
① 抗原递呈（antigen presentation） ② 抗原寻（antigen targeting） ③ 免疫调整（immune modulation）
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①抗原递呈: 指抗原分子递呈给T细胞方法。佐剂与疫苗联合使 用，有利于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性结合、 保护、运输并递呈给效应细胞。
（2）用明矾加碳酸钠合成法
2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑
（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成
A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl
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用铝粉加烧碱合成法:
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O
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（二）非颗粒性佐剂
1．肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其 衍生物、
去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调整多肽。
2．表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）
3．核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、 CpG
4．含硫复合物类佐剂：左旋咪唑
5．碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡 聚糖
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佐剂分类
1.按佐剂物理性质 颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂
2.按佐剂生物学性质（即Ballanti分类法） 微生物及其组分 非微生物物质
3.按佐剂在体内存留时间 贮存型佐剂（depot type adjuvant） 非贮存型（non-depot type adjuvant）
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不一样配方。
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兽医生物制品常见保护剂
1. 5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后， 110~116℃高压灭菌30~40 min。
2. 明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2% （g/m1）。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫 脲液加热溶解，116℃高压灭菌30~40min；
3. SPGA保护剂
蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛 血清白蛋白10g、加去离子水至1000ml, 混合溶解, 过滤除菌。
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第三节 免疫佐剂
一、佐剂概念与作用机理
1. 佐剂（新概念）: 凡是能够增强抗原特异性免疫应 答物质称为佐剂。
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二、常见灭活剂灭活机理与应用
(一) 灭活剂种类
1、甲醛溶液：
①蛋白质 ②核酸烷基化（不加中止剂）
2、烷化剂
乙酰基乙烯亚胺（AEI）
二乙烯亚胺(BEI)
缩水甘油醛
（使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代 硫酸钠中止灭活）
3、苯酚（石炭酸）：用于防腐， 极少用于疫苗研制
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作用特点: ① 显著增强抗原性微弱物质诱导机体产生
特异性免疫应答。 ② 用最少抗原和最少接种次数，产生足
够免疫应答。
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免疫佐剂作用机理
作用方式
① 改变正常免疫机能, 吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； ② 改变抗原构型, 使抗原物质降解, 并加强其免疫原性； ③ 延长抗原在组织内贮存时间, 使抗原迟缓降解和缓释,
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疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液：
可修复因冻干而受损细胞，使冻干制品含有一定量水 分；
可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔海绵 状，
增加溶解度
2. 赋形剂：
预防低分子物质碳化和氧化，保护活性物质不受加热 影响
使冻干制品形成多孔性、疏松海绵状物，增加溶解度
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佐剂（旧概念）: 当一个物质先于抗原或与抗原混 合或同时注射于动物Байду номын сангаас内，能非特异性地改变或 增强机体对该抗原特异性免疫应答,发挥其辅佐作 用物质.
以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所
改变，如IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不
一样, 含有免疫调整和免疫增强作用,单独使用时却
含有免疫原性。 灭活剂保护剂和免疫佐剂
灭活浓度: 多数为0.1％～0.3％
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烷化剂（alkylating agent）
乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、 缩水甘油醛
灭活机制:
1. 烷化DNA分子中鸟嘌呤或腺嘌呤等， 引发单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA 结构而破坏其功效，妨碍RNA合成，从而抑 制细胞有丝分裂。
6．细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2.IL-4和γ-IFN
等。 灭活剂保护剂和免疫佐剂
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氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法: （1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O
DMSO:二甲基亚砜，一个细胞保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时: 加脱脂乳（或二甲基亚
砜）和蔗糖等（不一样国家有不一样配方） ④ 干扰素类生物活性物质保留: 加葡聚糖
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保护剂（protector）分类
分类: （依据其作用机理） ——渗透剂: 如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 ——非渗透剂: 如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等 （依据其分子量大小） ——高分子物质、低分子物质。 （按其化学性质） ——复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
不超出3个月。 ④ 铝胶室温保留, 以免破坏胶态。
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油乳佐剂
是指一类由油类物质和乳化剂按一定百分比混合形成佐剂。
该类佐剂主要在抗原寻过程中起作用, 使抗原在注射部位保持稳 定, 为抗原在淋巴系统中转运提供载体, 增加单核细胞形成和积 聚。
油乳剂疫苗免疫效力高低, 直接与乳化作用好坏和乳剂成份质量 等相关。
两液等量逐步流入另一耐酸搪瓷缸 内, 蒸汽吹沸熟化10min, 调整pH 6.9 土0.1, 继续熟化3min, 稳定pH 6.9土 0.1
静置沉淀, 弃上清后加入约5倍量软 化水, 搅拌洗涤、弃上清, 如此3～5 次, 检验至硫酸盐合格为止。
另一缸盛80kg烧碱, 加水至 100万毫升, 加温至75℃
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用铜纱筛滤过, 用布袋脱水过夜, 收存 于容器内, 可约得600kg铝胶。
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注意事项
① 氢氧化铝吸附力较强, 所以要用软化水或去离子水洗涤。 ② 氢氧化铝胶为两性化合物, 过酸或过碱都会失去胶态。故要
掌握好化合时pH值。 ③ 贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中, 严密封盖, 贮放期
2. 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸
代谢。
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1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI） 淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 0～4℃可保留1年，在-20℃可保留2年 AEI功效基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 口蹄疫病毒液: 终浓度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸钠阻断
2.二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） 市购商品为0.2％BEI溶液，在0～4℃可保留1个月; 终浓度0.02%, 加入2％硫代硫酸钠中止灭活。
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3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA） 大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。 0～4℃ 3个月含量渐下降，约六个月失效；20℃只能保留10d。
4. -丙酰内酯（ －propiolactone）又名羟基丙酸- -内酯
无色有刺激气味液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保留
水中溶解度37％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合
对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。
病毒灭活后，能保持良好免疫原性
主要用于狂犬病灭活疫苗制备。
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三、影响灭活作用原因 1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常见。 2、微生物种类和特征 3、灭活剂浓度（一定要适合） 4、灭活温度（详细不一样病原体或毒素，其灭活时间 和温度不一致） 5、灭活时间 6.灭活PH值 7、有机物存在
4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）
用于诊疗抗原制备：鸡白痢抗原
5.β-丙酰内酯
病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用.
注意：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺
灭活剂保护剂和免疫佐剂 激性如：甲醛、β-丙酰内酯
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甲醛溶液:
《规程》（）中26种灭活疫苗
灭活机理:
氨基
甲醛
羧基
醛基
羟基
巯基
甲基胺 亚甲基二醇单酯 羟基甲酚 亚甲基二醇
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冻干保护剂作用机制
① 预防活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而造成生 物活性物质损伤；
② 降低细胞内外渗透压差、预防细胞内结构水结晶, 以保 持细胞活力；
③ 保护或提供细胞复苏所需营养物质, 有利于生活力复 苏和快速修复本身。
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二、影响保护剂效能原因
1.保护剂种类: 依据微生物种类或者用途来添加不一样种 类保护剂。
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一些常见冷冻干燥保护剂
分类
保护剂
复合物 糖类 盐类 醇类 酸类 聚合物
脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
② 厌氧性细菌: 含1.5％谷氨酸钠１％乳糖或10％脱
脂乳或7.5％葡糖血清。
注: 脱脂乳: 20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
（二）病毒保护剂
① 5%蔗糖 脱脂乳；
② 马立克814活细胞疫苗:保留液氮.稳定剂为10%二
甲基亚砜和50%犊牛血清199液。
注意: 微生物保护剂缓冲液组成百分比，不一样厂家
有
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（一）颗粒性佐剂
1．盐类佐剂
氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。
2．油水乳剂佐剂
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗
氏不完全佐剂（ FIA）和矿物油白油佐剂。
3．免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）
4．蜂胶佐剂（propolis）
5．脂质体佐剂（liposomes）。
２、保护剂浓度：严格按照配方执行。 ３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。 ４、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M影响。
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三、常见冻干保护剂（稳定剂）
明确不一样种类微生物需要添加不一样保护剂
（一）细菌保护剂
① 需氧或兼氧厌氧菌: ５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、
1.5％明胶；
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②抗原寻（antigen targeting）
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞效率。包含吸 引巨噬细胞抵达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与 细胞受体结合等有主要作用。
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③免疫调整（immune modulation） 是指任何能够修饰免疫效 应细胞反抗原或表位进行加工机制。经过这种机制, 能够改变 特异性免疫应答本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一 抗原和不一样佐剂一起使用能够引发不一样免疫反应。所以, 经过筛选特定佐剂, 能够到达诱导正确免疫应答目标。
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第二节 保护剂（稳定剂） 保护剂: 又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能预防生物 活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏物质。（指对疫苗生 产、血清制备等） 保护剂用途（不一样用途加不一样保护剂, 主要针对活微 生物或细胞）
① 菌种或毒种保留: 常见甘油作保护剂 ② 细胞株保留: 常见二甲基亚砜(DMSO)