N-乙酰半胱氨酸对纳米二氧化钛诱发细胞遗传损伤的保护作用

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CARCINO GENESIS ，TERATO GENESIS &MUTA GENESIS
2022年3月第34卷第2
期
收稿日期：2021-08-23；修订日期：2021-12-02
基金项目：国家自然科学基金(31860301，31900410)；云南省教育厅科研基
金项目(2020J0089)；云南师范大学博士启动基金项目
作者信息：王晗，E-mail ：*******************。

*通信作者，汪旭，
E-mail ：****************.cn
N-乙酰半胱氨酸对纳米二氧化钛诱发细胞遗传损伤的
保护作用
王
晗1，2，周滔1，2，徐云东1，
郭锡汉1，2，倪娟1，2，汪旭1，2，*(1．云南师范大学生命科学学院，云南
昆明
650500；2．云南师范大学生物能源持续开发与利用教育部工程研究中心，云南昆明
650500)
Protective effects of
N-acetylcysteine on genotoxicity induced by titanium dioxide nanoparticles in vitro
WANG Han 1,2,ZHOU Tao 1,2,XU Yundong 1,GUO Xihan 1,2,NI Juan 1,2,WANG Xu 1,2,*
（1.School of Life Sciences,Yunnan Normal University,Kunming 650500;2.Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy,Ministry of Education,Yunnan Normal University,Kunming 650500,Yunnan,China)
【摘要】目的：探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对纳米二氧化钛(TiO 2-NPs)诱发人正常肝细胞L-02和肺细胞HBE 遗传损伤的保护作用。

方法：分别将对数生长期的L-02和HBE 细胞分为3组，即正常培养的对照组、TiO 2-NPs(80μg/mL)暴露组、TiO 2-NPs (80μg/mL)与NAC(20μmol/L)联合暴露组；各组细胞处理72h 后，采用H 2O 2试剂盒检测细胞内H 2O 2浓度；实时荧光定量(qPCR)法检测L-02、HBE 细胞端粒长度(TL)的改变；胞质分裂阻断微核细胞组试验(CBMN-Cyt)评估受试细胞的染色体不稳定性(CIN)及细胞
死亡率。

结果：与对照组相比，TiO 2-NPs 暴露72h 后，可诱导L-02和HBE 细胞内H 2O 2浓度显著升高(P <0.05)，致使L-02和HBE 细胞TL 缩短、CIN 增加、细胞死亡率增加(P <0.05)；当TiO 2-NPs 与NAC 联合暴露72h 后时，两种受试细胞的H 2O 2水平和CIN 仍较对照组显著升高(P <0.05)，而TL 和细胞死亡率与对照组间的差异均无统计学意义(P >0.05)；与单独暴露TiO 2-NPs 组相比，联合暴露时两种受试细胞的TL 显著增加(P <0.05)，且CIN 及细胞死亡率显著降低(P <0.05)。

结论：抗氧化剂NAC 可抑制TiO 2-NPs 诱发的
人肝细胞L-02和肺细胞HBE 的TL 缩短和细胞死亡，维护染色体稳定，对细胞有一定保护作用。

【关键词】N-乙酰半胱氨酸；纳米二氧化钛；端粒；遗传损伤；保护作用
中图分类号：Q355
文献标志码：A
文章编号：1004-616X(2022)02-0093-05
doi ：10.3969/j.issn.1004-616x.2022.02.003
【ABSTRACT 】OBJECTIVE ：To investigate protective effects of N-acetylcysteine (NAC)on genotocicity induced by titanium dioxide nanoparticles (TiO 2-NPs)in human normal hepatocytes L-02and human normal lung epithelial cells HBE.METHODS ：L-02and HBE cells grown in log phase were divided into 3groups ：control group (normal culture)，TiO 2-NPs exposed group (80μg/mL)，and TiO 2-NPs (80μg/mL)and NAC (20μmol/L)co-exposed group.After the cells in each group were exposed for 72h ，H 2O 2kit was used to detect the intracellular H 2O 2level;telomere length (TL)of L-02and HBE cells in each group was measured by real-time quantitative PCR;chromosomal instability (CIN)and cell death indexes were evaluated by cytokinesis-block micronucleus cytome assay (CBMN-Cyt).RESULTS ：Compared with the control group ，TiO 2-NPs exposed for 72h significantly increased intracellular H 2O 2levels in L-02and HBE cells (P <0.05)，resulting in shortened TL ，increased CIN and cell death (P <0.05).When co-exposed with TiO 2-NPs and NAC for 72h ，the H 2O 2levels and CIN among the two types cells were significantly higher than those of the control group (P <0.05)，while TL and cell death had no significant differences compared with the control group (P >0.05).When compared with the TiO 2-NPs group ，increased TL (P <0.05)，decreased CIN ，and decreased cell death rates were found in TiO 2-NPs and NAC co-exposed group (both P <0.05).CONCLUSION ：The antioxidant NAC strongly reduced the telomere shortening and cell death induced by TiO 2-NPs in L-02and HBE cells ，showing the effects of protecting cells under the stress of TiO 2-NPs.
【KEY WORDS 】N-acetylcysteine ；titanium dioxide nanoparticles ；telomere ；genetic damage ；protective
effect
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纳米二氧化钛(titanium dioxide nanoparticles，TiO2-NPs)在日常生活中应用广泛，其对人体的遗传毒性效应已成为公共卫生领域关注的热点[1]。

已有研究表明，TiO2-NPs可在人体多器官尤其是肝脏和肺脏中大量累积[2]。

离体情况下，TiO2-NPs可以通过诱导细胞产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)、消耗细胞中谷胱甘肽，引起细胞炎症导致细胞死亡[3-5]。

部分动物实验表明，摄入过量的TiO2-NPs可激活肝、肺细胞中多种应激通路，引起细胞死亡，进而损伤肝、肺等器官[6-7]。

端粒(telomere)是稳固真核细胞染色体末端特殊且重要的结构，端粒长度(telomere length，TL)改变会影响染色体末端稳定和细胞增殖，诱发染色体不稳定(chromosome instability，CIN)，引起端粒功能紊乱，诱导细胞死亡甚至癌变[8]。

本课题组前期研究发现，TiO2-NPs可诱导人正常肝L-02细胞大量ROS产生、TL缩短、CIN升高[9]。

TiO2-NPs的遗传毒性可通过诱发TL改变，进而导致端粒功能障碍所致。

抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)表现出了较好的纳米颗粒遗传毒性抑制效应[10]。

那么，TiO2-NPs 诱导的正常细胞TL改变等遗传损伤效应，是否可以被抗氧化剂NAC抑制，成为本研究探究的重点。

因此，本文拟在人肝细胞L-02及肺细胞HBE中，采用TiO2-NPs单独暴露及其与NAC联合暴露，检测两种细胞TL、CIN及细胞死亡率的改变情况，为研究NAC在抑制TiO2-NPs诱发遗传毒性中的应用提供科学依据。

1材料与方法
1.1细胞株培养及分组处理
人正常肝细胞L-02(中国科学院上海细胞库)和人正常肺上皮细胞HBE(中国科学院昆明细胞库)分别培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中。

实验用TiO2-NPs(Sigma，德国)及NAC(索莱宝，北京)均用超纯水配制。

为确保TiO2-NPs分散液均匀，每次使用前均需要将分散液置于超声波清洗仪(220V，500W)分散处理20min。

分别取对数生长期的L-02、HBE细胞以3×105个/mL的浓度接种到6孔板中继续培养，待细胞贴壁后，将细胞分为3组，对照组(正常培养条件，无TiO2-NPs和NAC)，TiO2-NPs(80μg/mL)暴露组、TiO2-NPs(80μg/mL)与NAC(20μmol/L)联合暴露组，各组细胞培养72h后进行检测。

1.2过氧化氢检测
过氧化氢(H2O2)是ROS的主要成分之一，检测H2O2浓度可在一定程度上反映细胞内ROS的生成量。

利用过氧化氢检测试剂盒(碧云天，上海)收集各组细胞进行裂解，取上清液，用酶标仪测定D(560)，依据H2O2标准曲线计算细胞中H2O2浓度。

1.3端粒长度测量
利用DNA提取试剂盒(天根，北京)分别提取各组细胞总DNA，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)进行端粒绝对长度测量，测量基因组拷贝数的单拷贝基因选用36B4。

PCR所需引物、标准品序列及测量及计算方法参考文献[11]。

1.4胞质分裂阻断微核细胞组分析
分别收集各组细胞，加入终浓度为4.5μg/mL的细胞松弛素B培养细胞28h，进行细胞涂片；在光学显微镜下计数凋亡、坏死细胞，计算细胞凋亡率及细胞坏死率；以胞质分裂阻断微核细胞组试验(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMN-Cyt)分析染色体不稳定指标，即计数至少1000个双核细胞(binucleated cell，BNC)中微核(micronuclei，MN)、核质桥(nucleoplasmic bridges，NPB)及核芽(nuclear bud，NBud)的数量，并计算发生频率(‰)，三者频率相加得到细胞的总CIN频率，方法和指标判别参考文献[12]。

1.5统计分析
应用SPSS17.0软件，采用单因素方差分析和独立样本t检验对数据进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义，使用软件GraphPad Prism5.0作图。

2结果
2.1NAC与TiO2-NPs暴露对L-02、HBE细胞内H2O2浓度的影响
H2O2浓度检测结果显示，与对照组相比，TiO2-NPs暴露72h，可显著诱导L-02、HBE细胞内H2O2浓度升高(L-02细胞，P<0.01；HBE细胞，P=0.04)，当TiO2-NPs联合NAC暴露72h后，L-02和HBE细胞内的H2O2浓度仍较对照组显著升高(L-02细胞，P= 0.003；HBE细胞，P=0.006)，而与TiO2-NPs单独暴露组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

2.2NAC对TiO2-NPs暴露后L-02和HBE细胞端粒长度的稳定作用
对端粒长度进行测量后发现，与对照组相比，TiO2-NPs暴露72h后可诱导L-02和HBE细胞TL缩短(均为P<0.01)；而当TiO2-NPs和NAC共同培养72h后L-02和HBE细胞的TL与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，并且联合暴露下的两种受试细胞TL
显
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著长于TiO 2-NPs 单独暴露组(均为P <0.01)，见图2。

提示NAC 可维持TiO 2-NPs 暴露下的TL 稳定。

2.3NAC 对TiO 2-NPs 暴露后L-02和HBE 细胞染色体稳定性的促进作用
在肝正常L-02细胞和肺正常HBE 细胞中，与对照组比较，TiO 2-NPs 暴露均可显著增加细胞的CIN(均为P <0.01)；当NAC 与TiO 2-NPs 联合暴露时，L-02和HBE 细胞的CIN 较各自对照组亦显著升高(L-02细胞，P =0.025；HBE 细胞，P =0.008)。

与TiO 2-NPs 单独暴露组相比，NAC 和TiO 2-NPs 联合暴露组两种细胞的CIN 均显著降低(L-02细胞，P =0.002；HBE 细胞，P =0.03)，见图3。

2.4NAC 对TiO 2-NPs 暴露导致的L-02和HBE 细胞死亡的抑制作用
正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞经吉姆萨染色制片后，在形态学上均有显著差异。

正常细胞如图4A 所示，形态学上凋亡细胞有完整的细胞膜，染色质聚集，细胞着色比正常细胞深，细胞核边界清晰或核分解成核小体，包裹在完整的胞浆或胞膜内，并形成大小不一且染色更深的凋亡小体(图4B)；坏死的细胞在
形态学上表现为细胞膨胀、细胞膜不完整或直接不存在、细胞核呈无规则状且染色较浅(图4C)。

进一步统计分析TiO 2-NPs 和NAC 对受试细胞死亡方式的影响时，研究结果显示，TiO 2-NPs 暴露72h 后L-02和HBE 细胞死亡(凋亡和坏死细胞总和)率均较对照组显著增加(L-02细胞，P <0.01；HBE 细胞，P =0.012)，并以细胞坏死方式为主；而NAC 与TiO 2-NPs 联合暴露后细胞死亡率较TiO 2-NPs 单独暴露组显著降低(L-02细胞，P =0.004；HBE 细胞，P =0.007)，且联合暴露组与对照组间的差异无统计学意义(P >0.05，图4D 、F)。

值得一提的是，在比较细胞死亡方式时发现，与TiO 2-NPs 单独暴露相比，L-02细胞和HBE 细胞中，TiO 2-NPs 和NAC 联合暴露组的细胞坏死率均有所减少(图4E 、G)。

3
讨论
TiO 2-NPs 因其良好的着色性以及独特理化性质，已广泛应用在化妆品、食品加工等领域[12-13]，普遍认为，TiO 2-NPs 通过诱导细胞产生大量ROS 诱发细胞氧化胁迫，可诱导体外培养细胞微核率升高等效应，表现出遗传毒性[3-5，14-17]，抗氧化剂对其产生的遗传毒性具有一定抑制作用[18-19]。

端粒作为维护染色体稳定性的染色体末端结构，与细胞衰老、基因组不稳定性密切相关。

当细胞TL 改变，将诱导细胞衰老、死亡异常，甚至产生癌变[20]。

本研究首先将人正常肝细胞L-02和肺细胞HBE 单独暴露于TiO 2-NPs 中，发现TiO 2-NPs 显著诱导受试细胞内H 2O 2浓度升高，同时TiO 2-NPs 暴露后，两株受试细胞均表现出TL 缩短、CIN 率升高以及坏死率上升。

本研究提示TiO 2-NPs 可诱导细胞产生大量ROS ，
A ：L-02细胞内H 2O 2的水平变化；
B ：HBE 细胞内H 2O 2的水平变化.与对照组相比，*P <0.05，**P <0.01.
图1TiO 2-NPs 与NAC 暴露72h 后L-02和HBE 细胞内H 2O 2浓度的
变化
A ：L-02细胞端粒长度的变化；
B ：HBE 细胞端粒长度的变化.与对照组相比，**P <0.01；与TiO 2-NPs 暴露组相比，##P <0.01.
图2TiO 2-NPs 与NAC 暴露72h 后L-02和HBE
细胞端粒长度的变化
A ：L-02细胞染色体不稳定性的改变；
B ：HBE 细胞染色体不稳定性的改变.与对照组相比，*P <0.05，**P <0.01；与TiO 2-NPs 暴露组相比，#
P <0.05，##P <0.01.
图3TiO 2-NPs 与NAC 暴露72h 后L-02和HBE 细胞染色体不稳定
性的改变
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2
进而引起细胞氧化胁迫。

正是因为端粒作为胞内氧化损伤的敏感位点，易被ROS 攻击[21]，因此在TiO 2-NPs 暴露下受试细胞TL 缩短、CIN 升高，诱发端粒紊乱，产生遗传损伤。

在已确定本研究体系中TiO 2-NPs 可诱发受试细胞端粒长度缩短等遗传损伤的情况下，本研究引入抗氧化剂NAC 。

当TiO 2-NPs 与NAC 联合暴露后，结果发现，NAC 的加入能有效减缓TiO 2-NPs 暴露后两种受试细胞表现出的TL 缩短、CIN 率及细胞坏死率升高，尤其是在NAC 与TiO 2-NPs 共暴露下，两种受试细胞的TL 和细胞死亡率与对照组间的差异均无统计学意义，说明NAC 展现了良好的拮抗TiO 2-NPs 遗传损伤作用。

NAC 是一种在国内外许多研究中得到证实的抗氧化物质[18，22-23]，已有研究发现，NAC 预处理可明显降低纳米颗粒对离体细胞造成的氧化损伤[9]。

同时在体内环境下NAC 同样可抑制TiO 2-NPs 的毒性作用。

Elnagar 等[24]证实，喂饲NAC 可对TiO 2-NPs 造成的大鼠睾丸损伤起到一定保护作用，并能改善TiO 2-NPs 引发的DNA 损伤。

Smallcombe 等[25]同样发现NAC 预处理可减少TiO 2-NPs 引起的小鼠呼吸道损伤。

本文结果也提示，体外培养条件下，抗氧化剂NAC 可以有效抑制或减缓TiO 2-NPs 在人正常肝细胞L-02及人正常肺上皮细胞HBE 中引发的TL 异常，降低遗传毒性发生。

因TiO 2-NPs 最显著的毒性效应机制是造成细胞氧化胁迫，进一步诱导细胞产生氧化损伤，在本实验中，TiO 2-NPs 暴露引起了受试细胞内ROS 组分之一的H 2O 2浓度的显著升高。

然而，研究结果显示，TiO 2-NPs 与NAC 联合暴露并未明显降低因TiO 2-NPs 暴露所升高的胞内H 2O 2浓度，一方面可能源于本研究使用的NAC 剂量(20μmol/L)及处理时间(72h)还不足以完全抵抗高剂量TiO 2-NPs(80μg/mL)诱导产生的以H 2O 2为代表的ROS 水平，推测NAC 对TiO 2-NPs 诱导的细胞内ROS 产生的抑制作用可能依赖于抗氧化剂浓度或处理时间；另一方面，作为抗氧化剂，NAC 在未降低胞内ROS 水平的情况下，已经发挥了减缓受试细胞遗传损伤的效应，NAC 究竟通过何种分子机制，在不改变ROS 水平前提下有效抑制TiO 2-NPs 诱导端粒功能紊乱，有待进一步研究。

综上，本研究选用两种人组织来源的正常细胞，发现TiO 2-NPs 在人正常肝细胞L-02及人正常肺上皮细胞HBE 中暴露72h 后可以导致细胞内ROS 过量产生并引起细胞端粒功能紊乱；而抗氧化剂NAC 可有效抑制TiO 2-NPs 暴露下诱发的端粒功能紊乱，促进细胞的染色体稳定，阻止细胞死亡。

本研究提示，在日常生活中，在避免不了纳米颗粒暴露的情况下，补充一定剂量的抗氧化剂如NAC 等，可能会降低纳米颗粒暴
A ：正常细胞；
B ：凋亡细胞；
C ：坏死细胞；
D ：L-02细胞死亡率；
E ：L-02细胞中的凋亡和坏死比率；
F ：HBE 细胞死亡率；
G ：HBE 细胞中的凋亡和坏死比率.与对照组相比，*P <0.05，**P <0.01；与TiO 2-NPs 暴露组相比，##P <0.01.
图4TiO 2-NPs 与NAC 暴露72h 后L-02和HBE
细胞死亡情况
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露引起的细胞端粒功能紊乱等遗传毒性。

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