应用PCR技术扩增SRY基因检测性别

应用PCR技术扩增SRY基因检测性别
作者：吴晓东张博文王博楠等
来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2013年第14期
吴晓东，张博文，王博楠，李争芳，史莉莉，史铁伟，白春英
（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）
摘要：本文介绍了一种从基因水平快速、简捷地鉴定性别的方法及该方法的实际应用价值.PCR（polymerase chain reaction）技术是目前最常用的体外扩增DNA片段的技术，SRY （sex determining region of the Y）基因是男性特有的基因，位于Y染色体上.在SRY基因
区域设计特异的引物，利用PCR技术,以管家基因GAPDH为内参照，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.该法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别进行性别鉴定.广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定以预防X连锁隐性遗传病患儿的出生以及对有性别争议的运动员体检等.目前赤峰市的各大医院还未开展此技术，值得推广.
关键词：PCR技术；SRY基因；性别鉴定
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2013）07-0138-04
1 引言性别鉴定一直是医学领域的一个很有意义的话题，随着技术的不断革新，性别鉴定的方法也由过去传统单一的方法，逐渐向分子生物学多手段结合的方法过渡.传统方法，如通过性染色质鉴定性别，存在着准确率低的缺点[1].羊膜腔穿刺结合染色体核型分析方法，虽然准
确率高，但检测所需时间较长（约23天左右），且容易损伤胚胎，对于单胞胎来说，胎儿死亡率为0.6%，还有引发孕妇并发症的可能性.B超鉴定性别要求孕妇妊娠5个月以上，虽然安全性较高，但是受操作者的业务熟练程度等因素影响较大.相对传统方法来说，分子生物学方法最具优势[2].我们采用的是分子生物学的PCR扩增法，以男女都有的管家基因GAPDH为内参照，扩
增男性特有的SRY基因，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.
性别决定基因（sex determinationg region of the Y，SRY）指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段，是启动睾丸形成的主要基因.人的SRY基因位于Y染色体短臂Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质.SRY基
因在男性的减数分裂过程中，按父系遗传，涉及性别决定至少1亿3千万年了[3,4].
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA的技术[5].本
研究中利用PCR技术扩增SRY基因和内参照基因（GAPDH），可以在短时间内（3个小时左右）
获得大量的目的基因，然后通过电泳检测结果，根据是否可以扩增出SRY基因来进行性别的鉴定.从采样到出结果只需5到7个小时，该方法的优点是简单、快速、高效、敏感度高，样品可以取自带毛囊的毛发，血液，多年的尸块等.
所以，利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉
眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要
的现实意义.
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 材料及来源
外周血和毛发（含毛囊）均来自发育健康的志愿者，分别包括男性2名，女性2名.
2.1.2 试剂和药品
引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成；毛发基因组DNA提取试剂盒和血液提取基因组DNA试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖是西班牙原装进口；其它试剂和药品均为国内生产，由赤峰学院分子医学研究中心提供.
2.1.3 仪器设备
真空浓缩仪（VC-15SP）；PCR仪（ABI2720）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000）；全自动凝胶成像仪(Tocan240)，电泳设备(北京六一仪器厂)；低速离心机，高速离心机，涡旋混合仪，高压灭菌锅，eppendorf移液器等设备均由赤峰学院医学院分子医学研究中心提供.
2.2 方法
2.2.1 引物和样本 SRY基因和GAPDH基因引物的设计见表1，样本选择了外周血和带毛囊的毛发，之前的实验证明利用外周血基因组DNA扩增SRY基因判断性别是完全没有问题的，而用一根带毛囊的毛发是否能够扩增出SRY基因在本实验室还未曾做过，因此，设计实验时以男性的基因组DNA作为阳性对照，以女性的基因组DNA作为阴性对照.
2.2.2 样本的采集与处理
2.2.2.1 外周血的采集与基因组DNA的提取
（1）采血用带有抗凝剂(EDTA)的采血管采志愿者的外周血3mL，上下翻转5~6次，否则血液会出现凝集.
（2）收集白细胞血细胞中的红细胞没有细胞核，基因组DNA要从白细胞中提取.具体步骤见参考文献[6]，白细胞于-20度保存或直接提取基因组DNA. （3）从白细胞中提取基因组DNA 具体步骤如下：将上次实验获得的白细胞解冻，加入300μl红细胞裂解液，震荡混匀室温放置10min后12,000rpm离心1min，弃上清.其余步骤按试剂盒的方法进行，最后开盖放入预热的超小型离心浓缩仪，干燥5-10min，加入100μL DNA溶解液，充分混匀，-20℃保存.
(4)检测核酸的浓度和纯度取1μL基因组DNA，用超微量核酸检测仪检测核酸的浓度和纯度，结果见图1和表2.
2.2.2.2 毛发的采集与处理
（1）采样取男性和女性带有毛囊的毛发各一根.
（2）样本的处理将采集的毛发用70%乙醇洗涤1次，然后用蒸馏水冲洗毛发2次.在PCR 管中加入1根头发，毛囊置于管底，用洁净的剪刀剪去多余发毛发（高于PCR管的毛发部分）.PCR管中加入15μL裂解液，放入PCR仪中进行如下反应：65℃，
30min;95℃,15min;4℃,10min.反应结束后，将PCR管短暂离心，此裂解液作为毛发基因PCR的模板备用.
2.2.3 PCR体系和条件
2.2.
3.1 PCR反应体系
（1）毛发样品的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：毛发裂解液4μL，
2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，灭菌超纯水17，总体
积50μL.
（2）基因组DNA的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，基因组DNA（150-200ng/μL）1μL，灭
菌超纯水20μL，总体积50.
2.2.
3.2 PCR反应条件
首先94℃ 5min，然后94℃70sec，55℃90sec，72℃90sec循环30次，再72℃ 7min，最
后4℃保存.反应结束后，取样品5μL进行电泳检测，其余PCR产物于-20℃冰箱保存.
2.2.4 电泳检测配制2%琼脂糖凝胶和1xTAE电泳缓冲液，电泳按照5-8V/cm进行，120v
恒电压，运行0.5h.点样的顺序从左到右为：Marker I（条带为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp），男1号的基因组DNA，女1号的基因组DNA，男1号的毛发，女1号的毛发，男2号的基因组DNA，女2号的基因组DNA，男2号的毛发，女2号的毛发.将电泳后的凝胶放
入EB浸泡液中浸泡30min，凝胶成像系统Tocan240中观察，结果见图2.
3 实验结果
3.1 基因组DNA的纯度与浓度的检测结果用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计检测基
因组DNA的纯度和浓度结果见图1和表2.结果显示所测样品的基因组DNA紫外吸收值
OD260/280均在1.80-2.00之间，说明基因组DNA的纯度很高，可以用于试验操作.
3.2 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果
应用PCR扩增SRY基因电泳检测结果见图2，结果显示：①2、4、6、8泳道扩增出SRY基因，说明样本为男性样本，3、5、7、9泳道扩增出了男女都有的GAPDH内参照基因，但未扩出SRY基因，说明样本为女性样本，该实验结果与实际情况完全相符，证明该方法鉴定性别的准
确率极高.②用毛发检测SRY基因的结果与实际情况一致，说明用毛发鉴定性别可行，可以推广到实际应用中.
4 讨论
人或者哺乳动物的性别决定，首先依赖于生物体内染色体（主要是性染色体）的完整性，
一般来说，男性有一条X染色体和一条Y染色体，而女性有两条X染色体.1966年人们发现睾
丸决定因子（testis determination factor, TDF)决定了生物是否为雄性，直到1990年人们
才在此区克隆得到了SRY基因[7].因此，SRY基因的发现是哺乳动物性别决定领域研究的一项
重大突破，性别鉴定对于人类遗传病，法医鉴定，考古以及其它领域具有越来越重要的作用.特别是采用分子生物学手段比其他传统方法有着明显的优势.
4.1 该技术在胎儿性别检测中的应用优势.胎儿性别检测的方法有羊膜腔穿刺法、B型超声
波诊断法等，这两种方法检测性别各有特点.羊膜穿刺法对孕妇和胎儿都有侵入性伤害，其操作的创伤性，可导致宫内感染流产等多种妊娠不良；B超法要求胎儿发育到5个月以上才可以，
而且用超声波仪器分辨胎儿生殖器官要结合胎儿的位置和医师的水平，所以准确率并不高，5
个月后检测出性别再做流产时对孕妇的伤害很大.早在60年代末就有报道在孕妇血循环中存在
胎儿细胞[8],并提示可以利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行胎儿性别及X连锁遗传病、某些常
染色体遗传性疾病的产前诊断[9,10].因此，采用PCR技术扩增SRY基因检测性别法，可以用孕妇的外周血中游离的少量胎儿细胞进行性别鉴定，属于无创伤性检测.而且用PCR技术扩增SRY
基因检测性别法在怀孕早期（11周以后）即可进行鉴定[10].
4.2 法医鉴定的方法目前常用的就是PCR技术扩增SRY基因检测性别法，该方法具有快速、简捷和准确等特点，对样本的要求低，用一根毛发、一滴血均可检测出性别.
4.3 对于性分化异常的个体，如有些染色体检查为46,XX的个体却表现出部分男性的性状
或46，XY的个体却表现出部分女性特征时用PCR技术扩增SRY基因，原本SRY基因是位于Y染色体上的，但在形成生殖细胞进行减数分裂时X染色体和Y染色体发生易位而导致Y染色体上
的SRY基因易位到了X染色体上而出现性分化异常的现象.因此用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可以进行准确鉴定.
4.4 多年的尸块因大部分已降解无法判断性别时，用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可
不受降解的影响，因为该法检测的只是很少的一部分DNA.
4.5 对于有争议的运动员，多指表型像女性但怀疑是男性的运动员，可以用PCR技术扩增SRY基因检测性别法进行最终鉴定.
5 应用与推广前景
用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值.首先，材料来源广泛，只要有一滴血、一根毛发或多年的尸骨均可用来进行性别鉴定.其次，该方法具有简单、快速、高效、敏感度高等优点.利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域
具有重要的现实意义.
5.1 家族中有血友病或肌营养不良等X连锁隐性遗传病史的人有必要在怀孕后检测胎儿的
性别.通过采孕妇的外周血来检测胎儿的性别，可预防甲型血友病、杜氏肌营养不良等X连锁隐性遗传病患儿的出生，随着从孕妇血浆中提取胎儿游离DNA的技术手段不断革新，该方法在遗
传病的产前基因诊断中具有广泛而深远的实际应用价值[11-13].
5.2 案发现场发现血迹和毛发，需要检测性别时.性别鉴定是法医学个人识别的重要内容之一，用PCR 技术扩增Y染色体上的同源基因大大提高了性别鉴定的灵敏度，且检验程序简便快速，部分降解的检材只要能提取到相应的靶DNA序列即可进行，目前在法医学中已广泛应用[14，15].
5.3 由于多种原因无法确定性别时，如性反转综合征，用该法可为其临床诊断提供理论依
据[16].
5.4 多年的尸块大部分已降解需要鉴定性别时.考古研究中性别信息特别是重大考古和典型墓葬的考古发现对于墓主的性别等信息就显得非常重要以及对人类起源演化和迁移等研究也具
有十分重要作用，考古过程中由于挖掘墓葬，婴儿骨骼发育不全等情况无法进行形态学性别鉴定，而通过分子手段就显得尤为重要，多年遗骸比如尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA
的一小部分，不易受降解的影响，以DNA为基础的人骨遗骸性别鉴定最早就是用于扩增Y染色
体特异性序列进行的[17].因此，通过骨骼，牙齿，毛发（含毛囊）以及排泄物等提取出古代DNA，进行性别鉴定对于人类起源、演化和迁移等研究具有十分重要的作用.随着科学的进步，
利用PCR技术扩增SRY基因对考古进行性别鉴定的手段将会愈发的重要.
5.5 本方法还可用于需要快速、准确、同时需检测大量标本的运动员体检.
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