山东省地方绵羊品种的mtDNA D-loop序列多态性及系统进化研究

山东省地方绵羊品种的mtDNA D-loop序列多态性及系统
进化研究
黄庆华;张果平;王金文;崔绪奎;王建英;王可
【摘要】为了进一步了解山东省绵羊起源、群体遗传结构、群体遗传关系,利用线粒体DNA( mtDNA)分析了小尾寒羊、大尾寒羊、洼地绵羊3个地方绵羊品种(群体)的遗传多样性和起源进化.通过PCR和测序技术测定了3个绵羊群体82个个体的线粒体D-loop 1182 bp全序列,采用DnaSP 5.0进行多态性分析,并利用MEGA 5.05的邻接法(NJ)构建系统发育树.结果显示,3个绵羊群体mtDNA D -
1oop碱基组成:A、T、G、C平均含量分别为32.88％、29.33％、18.28％、19.50％,A+T含量明显高于G+C含量；碱基突变以转换为主,说明绵羊线粒体碱基替换存在转换偏倚现象.mtDNA D - loop区的核苷酸多样度分别为0.03240、0.02455和0.03172;单倍型多样度分别为0.971、0.728和0.932,表明小尾寒羊和洼地绵羊mtDNA D - loop区具有较高的多态性,遗传资源相当丰富,大尾寒羊相对较低,需要加强资源保护.构建的NJ系统发育树表明,3个绵羊品种内、品种间存在基因交流,品种间存在共同的起源.%To explore the origin, genetic structure and relationship of sheep breeds in Shandong Province, the complete 1 182 bp mitochondrial D - loop regions of 82 sheep individuals from 3 domestic breeds including Small - tail Han, Large - tail Han and Wadi sheep were cloned and sequenced. The sequences were analyzed by DnaSP 5.0 and the NJ tree was constructed by MEGA 5.05 software. The results showed that the average compositon of A, T, G and C was 32.88% , 29. 33% , 18.28% and 19.50% respectively. The content of A + T was obviously higher than that of G + C. Among base mutation, the majority
was transition, which suggested that transition bias was present in sheep mitochondria. The nucleotide diversity of three sheep breeds were
0.03240,0.02455 and 0.03172 respectively, and their haplotype diversity were 0.971, 0.728 and 0.932 respectively. The results indicated that there were higher polymorphism in mtDNA D - loop region of Small - tail Han sheep and Wadi sheep, but there was lower in the Large - tail Han sheep, so it needed to be protected. The NJ tree showed thai the three breeds had the same origin, and there was gene infiltration within them.
【期刊名称】《山东农业科学》
【年(卷),期】2012(044)005
【总页数】4页(P5-8)
【关键词】绵羊;mtDNA D-loop;遗传多样性;系统进化
【作者】黄庆华;张果平;王金文;崔绪奎;王建英;王可
【作者单位】山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,山东济南250100
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
山东省属暖温带季风气候类型，平原和丘陵面积大。

得天独厚的地理位置和生态环境条件形成了许多具有浓郁地方特色的绵羊品种，如小尾寒羊、大尾寒羊、洼地绵羊等。

山东省养羊历史悠久，多以农户分散饲养为主，由于缺乏严格的选配计划，局部地区的绵羊品种有退化现象;而且由于受到一些外来品种的影响，地方羊品种
的数量有所下降，品种纯度及遗传多样性在一定程度上受到威胁。

因此，开展山东省地方绵羊种质资源的基础研究，查清山东省地方绵羊品种最新动态，弄清其遗传结构和起源分化，对山东省地方绵羊遗传资源的评估、保护和开发利用具有重要意义。

线粒体DNA(mtDNA)呈环状闭合双链结构，分子量小、易变异、遗传自主、无组织特异性，属母系遗传，是目前研究动物起源、进化及群体遗传亲缘关系的理想对象[1]。

线粒体mtDNA D－loop区不编码蛋白，其进化速度在线粒体基因组中是最快的，是群体遗传研究中最有效和最灵敏的DNA区域。

检测这一区域DNA系列的变异，可以探讨亲缘关系较近的群体间的遗传分化[2，3]。

本研究对山东省小尾寒羊、大尾寒羊和洼地绵羊3个绵羊品种的mtDNA D－
loop区基因进行了比较分析，为了解山东省绵羊遗传资源的现状和品种的起源、
演化和分类，以及探讨绵羊资源的保存和利用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌DH5α菌株为本实验室保存菌种。

pMD18－T载体购自TAKARA公司。

DNA片段回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、2×Mix PCR购自TAKARA公司(大
连);氨苄青霉素(Ampicillin)、X－Gal、IPTG(异丙基－B－D －硫代半乳糖苷)购
自上海生物工程有限公司。

分别从山东省菏泽、聊城、滨州等各绵羊品种主产区采集绵羊群体耳组织5～10 g，置于离心管中，内装70%乙醇1 ml，迅速带回实验室，于－70℃冰箱中保存备用。

1.2 羊全基因DNA的提取
根据文献，采用酚－氯仿－异戊醇法从绵羊耳组织中提取全基因组DNA。

1.3 引物设计和PCR反应
根据文献[4]采用的绵羊mtDNA序列(Gen-Bank登录号:NC 001941)设计一对引物，引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

上游引物为:5'－AGCCCCACTATCAACACC －3';下游引物为:5'－AAATAGTTACCCCCACAGTTAG －3'，可扩增出1 182 bp片段。

PCR反应体系(25 μl):2 × PCR Mix 12.5 μl，10 μmol/L 引物各1.0 μl，DNA template 1.0 μl，用无菌双蒸水补充至25 μl。

PCR反应条件:94℃ 预变性3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，32个循环;72℃延伸 10 min。

PCR产物经凝胶电泳分离、胶回收试剂盒回收后克隆入pMD18－T载体中，测序。

1.4 数据统计分析
将获得的序列用DnaSP version 5.0软件统计多态位点数(number of polymorphic sites)、突变位点总数(total number of mutations)、单倍型数(number of haplotype)、单倍型多样度(haplotype diversity)、核苷酸多样度(nucleotide diversity)等种群参数[5]。

用MEGA 5.05进行转换与颠换数目的统
计和碱基组成分析，并采用邻接法(neighbor jointing，NJ)构建系统进化树，分
析它们的起源及系统进化[6]。

2 结果与分析
2.1 mtDNA D－loop区基因的克隆与测序
从菏泽、聊城、滨州等绵羊品种主产区采集绵羊群体耳组织，提取绵羊基因组DNA，利用设计的引物进行PCR，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，均获得了长度约为1 182 bp的片段(图1)，与预期的扩增片段长度相符，且特异性和重复性好。

纯化的mtDNA D－loop区PCR产物与pMD18－T载体连接，转化大肠杆菌DH5α。

挑取平板上的白色转化子提取重组质粒，送至上海博尚生物技术有限公司测序，测序结果与GenBank中已报道的绵羊mtDNA控制区全序列进行比对，同源性在92%以上，说明本试验扩增的DNA片段是绵羊的mtDNA D－loop区。

图1 3个绵羊品种mtDNA D－loop区的PCR产物M:DL2000 Marker;1～8:分别为mtDNA－loop区的PCR产物
2.2 3个绵羊品种mtDNA D－loop区的核苷酸组成
本试验测定的山东省3个绵羊品种的mtDNA D －loop区序列，A、T、G、C 四种碱基的比例分别为 32.88%、29.33%、18.28%、19.50%，符合哺乳动物线粒体DNA碱基组成的基本比例。

A+T的百分含量明显高于G+C的百分含量，碱基突变以转换/颠换为主，说明绵羊线粒体碱基替换存在转换偏倚现象。

2.3 3个绵羊品种mtDNA D－loop区序列的多样性分析
在82个样本的测序结果中，共检测到113个变异位点，单一多态位点(singleton variable sites)37个，占分析位点总数的3.13%，简约信息位点(parsimony informative sites)76个，占分析位点总数的6.43%，突变位点均为2碱基突变，没有发现3碱基和4碱基突变。

这些变异共定义了54种单倍型，单倍型多样度均较高，其中小尾寒羊多态性最高，达0.971，其次为洼地绵羊，大尾寒羊最低;小尾寒羊和洼地绵羊的核苷酸多样度都较高，而大尾寒羊相对较低(表1)。

表1 山东省3个绵羊品种mtDNA D－loop区序列的变异分析品种样本数量单倍型数单倍型多样度(H)平均核苷酸配对差异数(k)核苷酸多样度(Pi)28 23
0.971±0.031 28.870 0.03240大尾寒羊28 12 0.728±0.051 16.141 0.02455洼
地绵羊小尾寒羊26 19 0.932±0.054 25.690 0.03172
2.4 3个绵羊品种mtDNA D－loop区的系统进化分析
构建NJ系统进化树时，共利用了3个绵羊品种mtDNA控制区的12条序列及GenBank中公布的 AY091487(摩佛伦羊)、AJ238293(羱羊)、AY091490(盘羊)
和FJ545958(蒙古羊)序列。

构建的NJ系统进化树见图2。

Bootstrap检验结果表明，所构建的系统发育NJ树各分支的统计置信度均高于60%，说明所构建的系
统发育树的拓扑结构正确，且置信度较高。

图2 3个地方绵羊品种的NJ系统进化树STH:小尾寒羊;LTH:大尾寒羊;WD:洼地绵羊
图2显示，3个绵羊品种与摩佛伦羊的亲缘关系较盘羊与羱羊更近，可能存在共同的起源。

与蒙古羊亲缘关系较近，而且3个品种内、品种间也存在基因交流。

3 讨论
衡量一个群体mtDNA变异程度的2个重要指标是单倍型(基因)多样度(H)和核苷
酸多样度(Pi)。

单倍型多样度是指样本中随机抽取到两个不同单倍型的频率;H和Pi 越小，群体的多态程度越低，遗传多样性越贫乏[8]。

本试验对82个1 182 bp序列的单倍型数、单倍型比例、单倍型多样度、核苷酸多样度和平均核苷酸差异数的分析结果表明，小尾寒羊和洼地绵羊mtDNA存在丰富的多态性，遗传资源相当
丰富;而大尾寒羊遗传多样性较低，应采取措施加强资源保护。

大尾寒羊主要分布
在山东省临清市及其周边地区，由于尾巴硕大，充满脂肪，致使其产肉量和食用价值降低，加上近年来与其它品种绵羊进行杂交改良，纯种大尾寒羊存栏量逐年下降，2007年在畜禽遗传资源调查工作中，通过全面普查，临清市存栏纯种大尾寒羊实际数量仅1 008只，已达到濒危程度。

2006年大尾寒羊被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》，2009年被列入《山东省畜禽遗传资源保护名录》[9]。

根据文献报道，小尾寒羊原名“寒羊”，起源于宋朝中期，属于蒙古羊的派生种
[10]。

洼地绵羊是元朝引进的蒙古羊和明朝来自中亚的大脂尾羊杂交形成的[11]。

大尾寒羊的来源存在争议，有些学者认为起源于蒙古羊，而单乃铨考证认为大尾寒羊来源于阿拉伯脂尾羊[12]。

本研究构建的NJ系统发育树表明，3个品种间存在
共同的起源。

研究结果与张传生等[13]的相吻合，而与王桂芝应用血液蛋白质和杜立新等应用RAPD标记研究的结果有一定差异。

王桂芝[14]根据血红蛋白标记的
研究认为，洼地绵羊与大尾寒羊亲缘关系较近，大尾寒羊与小尾寒羊有不同起源。

杜立新等[15]应用RAPD标记研究结果认为，洼地绵羊与大尾寒羊遗传关系最近，与小尾寒羊遗传距离较大，3种绵羊共同起源于蒙古羊。

不同的研究结果可能是由于采用的方法不同所造成，直接测序法较其它方法更加灵敏，而且与所选序列有关，本研究选取了D－loop区全序列，而其他研究则选择了控制区的高变区。

本研究构建的NJ系统发育树还显示3个绵羊品种内、品种间存在基因交流，这可能是由于近年来受利益的驱动，越来越多的专门化高产品种挤占了地方品种应有的位置，真正纯种的地方绵羊品种数量越来越少;引入品种与地方品种杂交情况严重，以及地方品种自身的保护机构不健全，保种不利。

因此，制定有效可行的保护策略，有效维持地方品种的基本数量，已经成为山东省地方绵羊品种保护工作的当务之急。

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