佛甲草醇提物对佐剂性关节炎大鼠脾脏炎症相关蛋白表达的影响

Vol 44 NO. 5
MAY, 2022
第44卷第5期2020年05月
赣南医学院学报
JOURNALOFGANNANMEDICALUNIVERSITY 佛甲草醇提物对佐剂性关节炎
大鼠脾脏炎症相关蛋白表达的影响
曹性玲，吴丽珍，麻海娟，曾丽梅，周青
(赣南医学院基础医学院,江西 赣州341000)
摘要：目的:观察佛甲草醇提物对佐剂性关节炎大鼠细胞因子和炎症相关信号通路的作用。

方法:制备佐剂性 关节炎大鼠模型，Western blot 方法检测佛甲草提取物对大鼠脾脏组织中TNF c 、IBC B 、IBC7、、BC0、NF c B 及 a7nAChR 的蛋白表达。

结果:与模型组相比畐y - kg-1佛甲草治疗组TNF 丝(P <0. 01)、、BC 0(P < 0. 05)、IBC7 (P<0.05)及NF-pB(P < 0. 05)蛋白表达降低畐BC0( P <0. 01)及a7nAChR(P <0. 01)蛋白表达升高。

结论:佛
甲草醇提物可能通过调控脾脏的促炎和抑炎症细胞因子及相关信号，调节机体的免疫功能,从而控制佐剂性关节
炎诱导的急性和继发性关节炎。

关键词:佛甲草醇提物;佐剂性关节炎;NF-pB 信号通路;炎症因子中图分类号：R285
文献标志码：A 文章编号：1001 -5777(2020)05 -0477 -05
DOI ： 10. 3969/j. issn. 1001 -5775. 2020.05.010
The effectr oU Sedum lineere Thunb on inUammation-relatee prctein eepression in the spleen oU adjuvanp aUhUtP up
CAO Xing-Ung , WU Li-zher , MA Hai-juua , ZENG Li-mri , ZHOU Qing
(School of Basic Medicinr rf Gannan Medical Universite , Ganzhou , Jiangxi 341000)
Abstract : Objectivv : To observe the effects of Sebum Pneare Thund ( SLT ) on inOammato — factors and inOammato — related signaling pathways in RheymaWiP ArthriPs ( RA) rats. Methods ： Preparation of Rhexmatoid ArPribs Rats mod-
ci , the expression of the TNF-p , IL-10, 1-5 , IL-10, NF-pB and a7nAChR in RA —W spleen were UeWcWb by West ­
ern blot assay. Results ： Compared with the model group , the expression of TNF-p , IL-10 , IB-17 , NF-pB were downrep-
uPwb and the IB-10 , a7nAChR were uprepuPted in SLT yaxp. Conclusions : SLT can control acate and seconda —
arthritis induced by RA , the possible mechanism correlates with the repuPtion of pre-inOammato — and anU-inOammaW —
cyWhines, and repuPte the immune function.
Key words : Sedum Pneare Thunb alcohol extract ; aPjuvant arthribs ； NF-pB pathway ； inflammato — factor
类风湿性关节炎(rdexmatoid arthUtis , RA)是一■ 种病因不明的全身性自身免疫性疾病,以慢性破坏
性关节病变为特征,多表现为关节疼痛、肿胀及功能 障碍,致残率高。

目前临床用于治疗RA 的药物主 要以非笛类抗炎药、激素和细胞毒类药物等西药为 主,这些药物往往毒副作用大，可造成肝肾损害、骨
髓抑制、高血压等,并且这些药物的免疫抑制作用会 使人体正常的免疫功能大大降低，从而使患者易患
各种感染性疾病。

因此总体来说疗效并不是很理
想，患者经常很难坚持用药,使得治愈率很低。

应用中医药治疗RA 的历史很长并具有实际疗
效,其机制可能与调节免疫机能、改善血液流变性和 微循环、抗自由基损伤、调控细胞因子等有关4T 。

中医药不仅来源广泛、毒副反应小,而且具有多环
节、多层次、多靶点综合作用的特点,从中寻找具有 优良抗RA 活性的有效成分现已成为药物研发的重
要途径。

佛甲草(S —um Lio —a Thunh , SLT )为《中 药大辞典》收载的中药材，是景天科植物佛甲草的
基金项目：江西省卫生计生委中医药课题(NO.205A097)
作者简介:曹性玲,女,硕士 ,实验师,研究方向：中药药理研究。

E-mail :2_l_caoP005@ 193. com
赣南医学院学报2222年
全草，味甘、寒、无毒，具有清热、解毒、消肿、利胆等功效，传统中医用于咽喉肿痛、痈肿、疔疮、烫伤、蛇咬伤、痢疾、黄疸等。

本课题组前期研究结果表明，佛甲草可显著降低急性和慢性炎症反应，并对免疫功能具有调节⑷。

在佐剂性关节炎(adjuvant artUO-tW,AA)大鼠动物模型上，可以观察到佛甲草醇提物通过调节机体的免疫功能、减少炎性细胞因子及炎性介质的生成，抑制急性和继发性关节炎,降低脾脏指数。

本实验拟进一步探究SLT对佐剂性关节炎大鼠的作用，观察其对细胞炎性因子及相关信号通路蛋白表达的影响，以推测SLT治疗AA的机制。

为将佛甲草开发为治疗类风湿性关节炎的有效药物提供理论依据和研究基础。

1材料与方法
1-3实验药物佛甲草醇提物:佛甲草晒干后粉碎至粗粉，取适量蒸憎水加热提取3次，每次39mix,过滤，合并3次滤液并浓缩至适量，加入相当浓缩液3倍量45%乙醇，放置冰箱45h后减压过滤，滤液回收乙醇至无醇味并浓缩成2.5y-mL「9的溶液,实验前用生理盐水稀释至所需浓度供用；雷公藤多昔片(TOpte—gium wilfordil gpcasidas taPPi；TPT),黄石飞云制药有限公司生产,批号：20101001。

1.2动物SSrayue-DawPy(SD)大鼠，SPF级，雄性，体重(58±22)y,湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证书编号：SCXK(湘)2012-2004。

实验前进行适应性饲养1周。

1.3试剂完全弗氏佐剂(complete f—undS adju-vaoi,CFA),Sigma公司，货号：122K5770；0-actiu—■抗(Ta-24),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔pG (ZB-2303)及山羊抗鼠PG(ZBC305),北京中杉金桥生物技术有限公司；170(sc-7884)、IL-17(sc-377215)、ILC0(sc-365555)、NF-pB(sc-15)—抗，Santa Caz公司；a7nAChR(ab23832、和TNF-p (aP66574)—抗,Abeam公司；BSA蛋白浓度测定试剂盒畐匕京天根生化科技有限公司(J8539/M215)；HRP化学发光试剂盒，美国赛默飞世尔科技公司(1856135/556136)。

1.0方法1.
2.3分组、动物模型制备及给药24只SD大鼠，随机分为:正常对照组、佐剂性关节炎模型组、4a-kg-1佛甲草醇提物治疗组,8只/组。

各组大鼠左后足常规消毒后，于足底皮下注射02mL CFA 致炎，正常对照组注射0.3mL生理盐水。

第7d加强一针，复制佐剂性关节炎模型。

从造模前3d—直到造模后的第12d,各组分别给予佛甲草醇提物和等量的生理盐水，匚^次/d。

1.0.2Westea blvi方法检测脾脏组织中蛋白表达水平取22my脾脏组织于12mL离心管中，加入200裂解液，捣碎后,再加入440裂解液，置于4°C颠倒混匀1h o5000x a,°C,离心5mid。

取上清液BCA法行蛋白定量。

总蛋白50隅,加缓冲液，95C,min,2%SDS-BAGE凝胶电泳分离。

将分离出的蛋白转移至醋酸纤维素膜，加3%~5%的牛奶，封闭1h o不同的膜分别TNF c、、LC B、IL-17、ILC0、NF c B和a7nAChR—抗孵育畐C过夜。

二抗室温孵育1h o将化学发光试剂盒中的两种试剂按1：1比例混合，混匀后,在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1mix,于超高灵敏度化学成像发光仪照相，仪器自带软件测定各条带灰度值,与相应的内参比较后，将正常组值定为1,计算其余组相对值。

12统计学方法应用POsm5-0软件进行分析。

每个测量指标的数据均采用i±s表示，组间测定指标的整体比较采用单因素方差分析，组内各指标的多重比较则采用g检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.3佛甲草醇提物对AA大鼠脾脏NF-pB及细胞因子蛋白表达的影响如图1~7所示，与正常对照组比较，佐剂性关节炎模型组大鼠脾脏TNF-e(P< 0.001)、、LC0(P<021)、、L-17(P<0.05)及NF-pB (P<025)蛋白表达升高,a7nAChR(P<025)表达降低畐LC0(P<0.21)表达变化不明显;与模型组比较畐y-kg-1SLT治疗组TNF丝J P<021)、ILC0 (P<0.25),1-17(P<0.25)及NF-c B(P<0.25)蛋白表达降低,172(P<0.01)及a7nAChR(P< 0.01)表达升高。

5期
曹性玲，等佛甲草醇提物对佐剂性关节炎大鼠脾脏炎症相关蛋白表达的影响
(■E B J O %) u
二 q a •殳Uoss3
d s x a
.E alojd
u T d
图3佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏IC-lp 的影响 注:F = 11.321,P=0.003 4,正常组与模型组比较:
g=6.749,* * P<0. 41；治疗组与模型组比较：5 = 3.485,# P<0. 05。

a7nAChR
P-actin
图1佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏NF x B 及
细胞因子蛋白表达的影响
5 e .5.0.5.02 21.1.0.a
e K H O %).E _q a ・w
uo-s to
a dsxa
u _3o 」d z T d
图4佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏16-17的影响 注:F = 2 846,P =0.012 （，正常组与模型组比较:
g =5.554, * P < 0. 05 ；治疗组与模型组比较:?=
4.770,# P<0. 05。

图2佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏TNF x 的影响
注:F = 16.963 ,P = 0. 000 9,正常组与模型组比较：=
6.793,* * * P < 0. 001 ；治疗组与模型组比较：g =
7.43（,##P<0.0（。

e
K >J O %).E .q a i .
uo・ssd 」dsx
a)
u @o
」
d
o z -
图5佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏16-14的影响 注:F = 15.742,P=0.400 8,正常组与模型组比较: 9=0. 271, P >0. 05；治疗组与模型组比较:= 6.596,##P<0.0（。

赣南医学院学报2222
e K H O
%).E _q 3・M
uo・ssa 」dsx
a>m A lL N 图6佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏NF-pB 的影响
注:F=5.894, P =4. 418 2,正常组与模型组比较: g =4.667, * P < 4. 45 ；治疗组与模型组比较：g =
3.741,# P<
4. 45。

(§*8%
)
.E _q a
•安
uo«sa.ldsxa uQ4o 」d
图7佛甲草醇提物对AA 大鼠脾脏o7nAChR 的影响
注2 = 18. 185,P=4.042 8,正常组与模型组比较: g =3.537, * P < 2. 25 ；治疗组与模型组比较：g =
8.492,##P<2.21。

3讨论
RA 是
常见的慢性、炎症性、渐进性的自
身免疫性疾病，目前尚
的治疗方法。

它的病
迄今,RA 的病因还不太明确，有研究显示，促 炎细胞因
炎细胞因子的失平衡在RA 的发病
显著 E 9。

我们的前期研究发现，SLT 显 著降低AA 血清TNF-w 、IL-6水平及关节液
PGE2含量，降低脾脏指数。

提示SLT 可调控AA 发
病时细胞因
的失调，脾脏参与其中。

NF-cB 在正常情况下位于细 内,以pP5/-52异源二
存在，在静息状
，NF-cB 与
其 性
因子I k B 结合在一 复合物,I k B
NF-cB 进入细 ，调控相关的靶基因。

NF-cB 彳 参与多种免疫炎症的调节［43o 有研
究表明NF-cB 与炎性细胞因子(TNF l 、ILL 、IL-6 等)之间具有相互作用，可彼此激活、调控⑴-03,这 两者的共 使得炎症 。

当减少NF-cB
的
，RA 的症状可显著减轻［4-153o 因此
NF-cB 及炎性细胞因子的
是治疗RA 的一个重
要切入点。

a 烟碱型乙酰胆碱受体(a7 nicotinic ucetyi-
cholioor receptor , a7nAChR )由同源五聚体所组成,
属于神经元型乙酰胆
，是一种
控离子
通道，在胆碱能抗炎通路(Cholioerylo Anti-lnflammu-
Wrp Pathway,CAP )中发挥重 。

胆 炎通
是神经-免疫调节
的一种，在全身炎症反应
重 ,
炎性细胞因子的合成和
放，对炎症的发生发
［15 -20 3 o
验结果显示，佛甲
提物(4g ・kg-1)可
明显降低AA 大鼠脾脏组 NF-cB -52的 ：,
TNF-w 、ILL 0、、LL7等促炎细胞因
降
，抑炎细胞因子ILL0及a7nAChR 升高。

由
此 甲 提 对 AA
关节炎症的治与
NF-c B ， 、激活胆
炎通
、调节机体的免疫
细胞因 平 关。

考文献：
变 主
滑膜炎以及关节腔内血管内皮生成,
关节、对称的侵入性炎症，使得骨软骨损
伤、关节被破坏以及关节畸形［3, 3
器
伤［0■2 3 o 因此，治疗RA 首先要减少炎症反应。

AA 模型的
、病理变化等与人类
RA 非常
，是常用的一种免疫性炎症模型。

我
期研究发现AA
型组原发性、继发性足
肿 常明显，佛甲 提物(4, 5 y • kg-1)能明 显 AA 原、继发性足跖肿胀程度，对 <
AA 有明显改善作
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(收稿日期：205-16-20)(责任编辑:刘仰斌)。