斜纹夜蛾和甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后的变异

斜纹夜蛾和甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后的变异
王成燕;钟万芳;刘宝生;方继朝;郭慧芳
【摘要】To study the recombination characteristics between nucleopolyhedroviruses ( NPVs) , and reveal the rules of evolution in NPVs and explore new NPVs with expanded host range, two NPVs[ Spodoplera litura NPV (S1NPV) and S. exigua NPV (SeNPV) ] were used to co-infect alive host in vivo. The biological activities of NPVs before and after co-infection were determined, and the ultraslructure of polyhedra were observed under transmission electron microscope. The results showed that, oral co-infection of S1NPV and SeNPV resulted in a new strain of NPV
( SINPV-1 ) which could infect both 5. litura and S. exigua. The lethal concentration of 50 percent individuals ( LC50) of SINPV-1 against S. litura was not significantly different from that of SINRV. The biological aclivity of S1NPV-1 against 5. exigua, was significantly lower than that of SeNPV. The ultrastructure of polyhedra in SINPV-1 was not significantly different from that of S1NPV. Restriction enzyme profiles of genomic DNA from S1NPV-I was the same as that of S1NPV. All these results indicated that coinfection of S1NPV and SeNPV in vivo could generate a new strain of NPV with an expanded host range againt both S.litura and S. exigua.%为了明确不同宿主域核型多角体病毒(NPV)间的重组特性,揭示病毒进化规律以及发掘宿主域扩大病毒,本试验将2种病毒[不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾核型多角体病毒日本福冈株(SlNPV)、不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾核型多角体病毒美国株(SeNPV)]共同侵染宿主活体,通过饲料添毒法测定病毒异源重组前后的活性,并进一步通过透射
电镜观察病毒多角体超微结构,利用限制性酶切比较病毒基因组遗传差异.结果发现,SlNPV和SeNPV在共同经口侵染甜菜夜蛾后,产生能成功侵染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大重组病毒(SlNPV-1)株系,其对斜纹夜蛾的致死中浓度(LC50)与SlNPV间无显著差异,同时SlNPV-1对甜菜夜蛾的侵染力显著低于
SeNPV.SlNPV-1株系的超微结构与SlNPV无显著差异.另外,SlNPV-1基因组DNA限制性酶切图谱与SlNPV的图谱相同.表明,SlNPV和SeNPV混合侵染活体宿主后,能产生对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾都具有侵染活性的宿主域扩大重组病毒.【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2012(028)005
【总页数】5页(P986-990)
【关键词】甜菜夜蛾;斜纹夜蛾;核型多角体病毒;宿主域;多角体超微结构
【作者】王成燕;钟万芳;刘宝生;方继朝;郭慧芳
【作者单位】南京农业大学植物保护学院,江苏南京210095;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014
【正文语种】中文
【中图分类】S436.634.2+9
昆虫杆状病毒间自然重组现象较为普遍，部分重组引起病毒侵染特性的改变，如扩
大宿主域、提高杀虫活性等［1-2］。

在昆虫活体或细胞内利用共同侵染获得重组病毒株系不仅对于揭示病毒进化规律具有重要作用，而且也为生产上开发应用高效广谱病毒提供有效途径。

关于核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)间重组，最早研究了苜蓿银纹夜蛾NPV(Autographa californica NPV，AcNPV)和刺金翅夜蛾NPV(Rachiplusia ou NPV，RoNPV)，发现两者共同感染大蜡螟幼虫时得到不同于2个亲本的重组病毒［3］。

后又发现AcNPV与家蚕
NPV(Bombyx mori NPV，BmNPV)共同感染草地贪夜蛾细胞(Sf-21)后亦发生了重组，病毒宿主域得到扩大，能同时成功侵染Sf-21和家蚕细胞［1］。

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)作为杂食性害虫，可为害蔬菜、棉花等多种作物，是农业上的重大害虫。

斜纹夜蛾NPV(SlNPV)和甜菜夜蛾NPV(SeNPV)均已被开发为生物杀虫剂用于害虫的防治，然而上述2种病毒主要感染其各自的宿主，而生产上2种害虫常同期发生，现有的病毒杀虫剂难以满足对2种害虫的兼治。

因此，如何利用SlNPV和SeNPV间的重组实现病毒杀虫谱的扩大值得研究。

刘彦文［4］曾发现SlNPV病毒核衣壳与SeNPV基因组DNA的BamHⅠ酶切片段，以及 SeNPV病毒核衣壳与 SlNPV基因组DNA的BamHⅠ酶切片段共转染后，均获得了寄主范围扩大的重组病毒，但尚未有关于SlNPV和SeNPV在活体重组后病毒宿主域变化方面的研究报道。

本试验拟用对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾无交互侵染能力的SlNPV日本福冈株和SeNPV美国株共同感染甜菜夜蛾幼虫，试图研究混合侵染后病毒宿主域的变化，并进一步研究病毒宿主域扩大后其多角体超微结构和基因组限制性酶切图谱的变化，以期为生产上提供杀虫广谱的病毒新资源及揭示SlNPV和SeNPV自然种群中为何存在丰富多样性提供参考。

1 材料与方法
1.1 供试昆虫和病毒
斜纹夜蛾和甜菜夜蛾均为室内长期人工饲养，已连续饲养40多代。

饲养温度为(27±1)℃，光照时间为14 h，虫卵用2%甲醛消毒，幼虫3龄前群体饲养，3龄后单头饲养。

试验选用龄期一致的健康幼虫。

SlNPV日本福冈株和SeNPV美国株均为江苏省农业科学院植物保护研究所虫害研究室长期保存，分别在斜纹夜蛾和甜菜夜蛾中繁殖3代后用于试验。

病毒纯化后适当稀释，用血球计数板计数，4℃冰箱保存备用。

蛋白酶K(Proteinase K)及限制性内切酶PstⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ均为TaKaRa产品。

1.2 宿主域扩大的重组病毒的分离
将不能经口感染斜纹夜蛾的SeNPV美国株和不能经口感染甜菜夜蛾的SlNPV日本福冈株按多角体浓度1∶1(均为1×108PⅠB/ml)采用饲料添毒法混合感染100头3龄中期甜菜夜蛾，每头试虫接毒剂量为10 μl，感染致死后收获病虫，对核型多角体病毒进行纯化。

再将纯化后的多角体病毒以10 PⅠB/m l多角体的低剂量感染4龄初期斜纹夜蛾幼虫，共接种108头斜纹夜蛾，放于6孔板中，每孔1头，各病虫分开收集，并分别纯化，此时获得的病毒即为能够同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的病毒新株系。

1.3 病毒活性的测定
采用饲料喂毒法测定病毒新株系对3龄中期斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫的活性。

将人工饲料切成相同小块(确保24 h内吃完)，加入灭过菌的24孔板中，加10 μl病毒悬浮液，分别接入大小一致3龄中期甜菜夜蛾或斜纹夜蛾，每孔1头，每个处理2块板，同时以清水空白为对照。

试验在(29±1)℃培养箱中培养，每日调查病死虫数，直到不再有病死幼虫出现。

每个试验重复3次。

应用DPS软件并采用Tukey’s法进行差异显著性统计分析。

1.4 病毒多角体超微结构观察
将经过蔗糖密度梯度纯化的核型多角体病毒悬液与2%琼脂混匀，凝固后按常规方法进行固定、脱水、包埋、聚合，样品经超薄切片及醋酸铀和柠酸铅溶液双染色后，在JEOL-100CXⅠⅠ透射电镜下观察拍照。

每种病毒至少拍摄40个以上多角体，对所有能清楚观察到的核型多角体病毒进行病毒束及病毒束中病毒核衣壳的计数，各病毒至少对7个以上核型多角体病毒和24个以上病毒束进行观察计数。

应用DPS软件并采用Tukey’s法进行差异显著性统计分析。

1.5 病毒基因组DNA的限制性酶切试验
参照郭慧芳［5］的方法从 SlNPV中提取 DNA，Tris(三羟甲基氨基甲烷)-
EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液(PH 8.0)溶解后，于 -20 ℃保存。

1～2 μg的病毒DNA用10 U限制性酶进行酶切，37℃酶切4 h后，用为酶切反应液1/6体积的
上样缓冲液停止反应，0.8%琼脂糖凝胶电泳，拍照。

2 结果
2.1 2种核型多角体病毒异源重组前后的毒力变化
将SeNPV美国株和SlNPV日本福冈株混合侵染甜菜夜蛾后，再将甜菜夜蛾中获
得的病毒以低剂量感染斜纹夜蛾，仅有1头斜纹夜蛾感染病毒而死，从中收集的
宿主域扩大重组病毒(SlNPV-1)在斜纹夜蛾中大量繁殖1代后用于病毒毒力的测定。

对SlNPV-1和其2个亲本病毒SeNPV和SlNPV生物活性进行比较，结果(表1)
表明，SlNPV-1对斜纹夜蛾的致病力与混合侵染前SlNPV无显著差异，对3龄幼虫的致死中浓度(LC50)为3.16 ×108PⅠB/ml，对甜菜夜蛾也有一定的致病力，对3龄幼虫的LC50为5.53 ×107PⅠB/ml，显著低于 SeNPV 对甜菜夜蛾的毒力(P
＜0.05)。

结果表明，SeNPV和SlNPV在共同经口感染甜菜夜蛾后，产生了能感
染斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的宿主域扩大重组病毒。

表1 斜纹夜蛾和甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后对2种宿主的致病力Table 1 Virulence of NPVs against S.litura and S.exigua after heterogeneous
recombinationSlNPV为不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾核型多角体病毒日本
福冈株，SeNPV为不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾核型多角体病毒美国株，SlNPV-1为斜纹夜蛾和甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后产生的宿主域扩大重
组病毒。

靶标对象病毒斜率±标准误致死中浓度(PⅠB/ml，95% 置信限)卡方值(χ2) P值斜纹夜蛾 SlNPV-10.7149 ±0.0985 3.16 ×108(1.22 ×108～1.41
×109)2.8367 0.4175 0.4224 0.5686 SlNPV 0.5811 ±0.1356 2.14 ×107(6.89
×106～3.38 ×108) 2.1292 0.5460甜菜夜蛾 SlNPV-10.6955 ±0.0814 5.53
×107(2.82 ×107～1.31 ×108) 3.3164 0.3454 SeNPV 0.6943 ±0.1244 2.01
×106(1.15 ×106～4.25 ×106)
2.2 2种核型多角体病毒异源重组前后的多角体超微结构比较
通过透射电镜观察了SlNPV和SeNPV混合侵染前后核型多角体病毒的超微结构，结果(图1)发现，病毒混合侵染后产生的宿主域扩大重组病毒(SlNPV-1)在多角体
形态及超微结构上与其亲本病毒无显著差异，重组核型多角体病毒均为不规则多边形或卵圆形，其大小不一。

另外，重组核型多角体病毒均为多粒包埋型病毒，即每个病毒束中包埋1个以上病毒核衣壳。

图1 SlNPV和SeNPV异源重组前后核型多角体病毒的超微结构Fig.1 Ultrastructure of polyhedra from SlNPV，SeNPV and SlNPV-1A:斜纹夜蛾和
甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后产生的宿主域扩大重组病毒;B:不能经口感染
甜菜夜蛾的斜纹夜蛾核型多角体病毒日本福冈株;C:不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜
夜蛾核型多角体病毒美国株。

进一步对核型多角体病毒内病毒束中病毒核衣壳数进行比较，结果发现，由SlNPV和SeNPV混合侵染后产生的SlNPV-1中每个病毒束包埋病毒核衣壳数量
与其2种亲本病毒束间均无显著差异(P＞0.05)，平均每个病毒束包含3.2个病毒
核衣壳，2个亲本病毒间也无显著差异(P＞0.05)。

对核型多角体病毒内病毒束的数量进行比较，结果发现，SlNPV-1中病毒束数量
与其2种亲本病毒束间无显著差异，平均每个多角体病毒包含15.5个病毒束，同样，2个亲本病毒间也无显著差异(P＞0.05)。

不同数量病毒核衣壳的病毒束的分布结果(图2)表明，SlNPV-1中各病毒束内病毒核衣壳数量变化较大，每个病毒束内包含的病毒核衣壳数为1～9个，超过75.0%的病毒束中病毒核衣壳数量在4个以下，其中含1、2、3和4个病毒核衣壳的病毒束分别占20.0%、27.5%、15.0%和 15.0%，少于25.0%的病毒束中病毒核衣
壳数量超过4个，仅有2.5%病毒束中病毒核衣壳数量为9个。

SlNPV中病毒束内病毒核衣壳数量变化较大，每个病毒束内包含的病毒核衣壳数为1～9个，有63.0%的病毒束中病毒核衣壳数量在4个以下，6.7%病毒束中病毒核衣壳数量达9个。

而SeNPV多角体中病毒束里病毒核衣壳数量变化较小，每个病毒束内包含的病毒核衣壳数为1～4个，含3个病毒核衣壳的病毒束占62.5%。

图2 SlNPV和SeNPV异源重组前后病毒束中不同病毒核衣壳数的分布Fig.2 Frequency of nucleocapsids from SlNPV，SeNPV and SlNPV-1
2.3 2种核型多角体病毒异源重组前后病毒基因组DNA限制性酶切图谱
对SlNPV和SeNPV异源重组前后病毒基因组DNA进行了限制性酶切图谱比较，结果(图3)表明，SlNPV和SeNPV混合侵染后产生的SlNPV-1的基因组DNA分别用PstⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ4种限制性酶进行酶切的图谱均与混合侵
染前SlNPV的图谱相同。

图3 SlNPV与SlNPV-1基因组DNA的限制性酶切图谱Fig.3 Restriction enzymatic digestion of genomic DNA of SlNPV and SlNPV-11～4为不能经
口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾核型多角体病毒日本福冈株;5～8为斜纹夜蛾和甜菜夜蛾核型多角体病毒异源重组后产生的宿主域扩大重组病毒。

1和5为PstⅠ酶切;2和6为HindⅢ酶切;3和7为EcoRⅠ酶切;4和8为XbaⅠ酶切。

3 讨论
宿主域扩大重组病毒的开发具有广阔前景［6］。

不同宿主域核型多角体病毒间的重组为筛选获得广谱病毒新株系提供了有效途径，为揭示病毒丰富多样性的产生机理提供了证明实例。

在重组病毒研究中，前人的研究更多的是在昆虫细胞内进行，而要发掘田间有应用前景的宿主域扩大病毒新株系，需在活体宿主内进行病毒的混合感染研究，以获得对活体宿主有强致病力的广谱病毒株。

另外活体内病毒的研究也更接近田间实际，有利于解释病毒进化的生态学意义。

本试验中涉及的SlNPV 和SeNPV分别对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾有高的致病力，但两者不能相互经口感染活体宿主。

生产上斜纹夜蛾和甜菜夜蛾均是农业上重要害虫，二者常在蔬菜和棉花等上混合发生。

另外，SlNPV和SeNPV在自然界中均具有丰富的多样性［7-9］。

本研究将SlNPV和SeNPV混合感染甜菜夜蛾，再在斜纹夜蛾中筛选出对两者均有致病力的病毒株系，此病毒株系将为生产上提供可兼治斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的生物防治新资源。

对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)共同感染产生的异源重组病毒的研究结果表明，AcNPV p143基因编码的DNA解旋酶区域，是病毒DNA复制所必需的，其决定着 AcNPV的宿主范围，病毒宿主域扩大与p143基因整合的一个BmNPV解旋酶基因编码区的600 bp 片段有关［1，3，10-11］。

本试验对SⅠNPV 和 SeNPV异源重组前后的病毒基因组DNA的限制性酶切结果表明，其酶切图谱间不存在差异。

初步表明Sl-NPV和SeNPV异源重组后产生的宿主域扩大重组病毒的基因组未有大片段的插入或缺失。

在NPV中，多角体蛋白质基因(polh)是非常保守的基因，与病毒的宿主域相关，已发现致病力和增殖能力差异大的4株SlNPV日本株中polh基因编码区序列存在差异［12-14］。

除此外，细胞凋亡抑制蛋白质(Ⅰnhibitor of apoptosis protein)iap基因、P35 基因、hrf-1 基因［6，15-16］和 AcNPV 的 lef-7 基因
［17］等也均与病毒的宿主域密切相关。

本试验中病毒宿主域的扩大是否涉及了
上述基因的变异?除此以外，还有无其它变异?这些均值得进一步研究。

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