最新丁基苯酞对大鼠缺血脑组织Bcl-2表达的影响_李其富-药学医学精品资料
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ref：黄如训等.中国新药杂志,2005,14（8）:985-988
2.NBP对Bcl-2表达的影响
缺血后Bcl-2上调的表达时限尚无统一认识，本研 究发现局灶性缺血72h， Bcl-2蛋白和mRNA水平 在梗死灶周围和海马区仍处于较高水平，NBP组 Bcl-2的表达更为明显。推测NBP能够上调Bcl-2的 表达水平和延长表达时限，其具体机制有待于进 一步研究 ； 梗死周围区Bcl-2表达最强，梗死核心区表达较弱 推测脑缺血时Bcl-2的表达可能必须具备缺血和细 胞轻度损伤两个条件，而一旦神经细胞损伤到 DNA崩解的程度，它们的合成也即停止。
目的
研究大鼠局灶性脑缺血时,给予NBP干预对内源 性Bcl-2和Bcl-2 mRNA表达的影响; 探讨NBP在大鼠缺血性脑损伤中的神经保护作 用可能的机制，为临床药物应用提供实验依据。
材料和方法
材料
实验动物
健康雄性SD大鼠60只，二级动物，3-4月龄，体重280g-350g， 成都中医药大学实验动物中心提供。
试剂及药品
NBP由石药集团恩必普药业公司提供，使用前用植物油稀 释10倍配成溶剂。 Bcl-2抗体和原位杂交试剂盒，武汉博士得生物技术有限公 司生产。 TTC，DAB显色试剂盒、P试剂盒、4%多聚甲醛及其它试 剂和药品由实验室提供。
实验方法（1）
建立大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO）
3天后SD大鼠
神经功能
缺损评分
实验方法 （4）
评价指标
神经功能缺损评分：Zea-longa 5分制评分法 梗死体积观察与测量：TTC染色
Bcl-2蛋白表达：采用SP免疫组织化学染色
Bcl-2 mRNA表达：采用原位杂交(POD)法
实验方法 （5）
结果判定
阳性细胞判定 免疫组化：阳性细胞的胞浆、胞膜、轴突着色呈棕黄色。 原位杂交：阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。 图象采集分析 Olympus显微照相系统采图，每只动物取梗死周围大脑皮 质、海马和梗死区保存较好部位，光镜下每个部位分析5个 视野。 image pro plus 5.02专业图象分析软件进行分析，采用积分 光密度值（IOD）进行统计学分析。
模型对照组
ISH×400
NBP组
讨论
1.NBP对神经功能评分及梗死体积的影响
本研究所采用Zea-Longa法建立大鼠MCAO模 型，其神经行为学、脑组织病理上接近临床， 适于脑缺血性卒中治疗实验研究。 本研究发现，与模型对照组相比，NBP在治 疗缺血后神经功能缺损和梗死体积在治疗组 均明显改善，与NBP前期研究结果相一致， 表明NBP对缺血卒中具有改善神经功能损害 的作用。
统计学方法
对所得数据用SPSS10.0软件包进行数据分析， 组间计量资料比较采用单因素方差分析（ oneway ANOVA ），计数资料采用秩和检验。 检验水准：P<0.05为有统计学意义。
结 果
1.神经功能缺损评分（NDS）
干预前NBP组和模型对照组 NDS比较P＝0.63 干预后NBP组和模型对照组 NDS比较P＝0.04
2.梗死体积比较
NBP组和模型对照组梗死体积比较 P <0.01。
3. Bcl-2蛋白表达
IOD
梗死周围区
海马区
梗死核心区
(积分光密度（IOD）值表示蛋白表达的相对强度，值越大表达越强) NBP组在梗死周围区和海马区，Bcl-2表达明显高于模型对照组（P<0.01） 在梗死核心区各组Bcl-2表达无显著性差异（P>0.05）
梗死周围区Bcl-2表达
模型对照组
IHC×400
NBP组
4. Bcl-2 mRNA表达
梗死周围区
海马区
梗死核心区
NBP组在梗死周围区和海马区，Bcl-2 mRNA表达明显高于对照组（P<0.01） 在梗死区各组Bcl-2 mRNA表达无显著性差异（P>0.05）
梗死周围区Bcl-2 mRNA表达
实验路线
造模 麻 醉 大 鼠 SD
仅行颈部血管分离而不栓塞
评分
分组
随机数字表
NBP组 （20只）
NBP灌喂3d 25mg/Kg, Bid 采集标本
பைடு நூலகம்
Zea-Longa法 1-3分
模型对照组 （20只） 假手术组 (20只）
相应剂量植物 油灌喂3d
实验方法 （3）
标本采集
处 死 取 脑
每组5只 TTC染色 免疫组化 15只多聚 甲醛固定 原位杂交
Ref: Longa EZ, et al. Stroke, 1989; 20(1):84-91.
手术操作图示
实验方法 （2）
动物分组
假手术组20只大鼠 （大鼠建立MCAO模型后，采用随机数字表法分组） 模型对照组和NBP组各20只。
动物处理
动物清醒后，假手术组、模型对照组（B、D组）予以食用植 物油灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后处死 。 NBP组予以NBP灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后 处死 。
采用稍加改良的Zea-Longa法，将SD大鼠制备为大脑中动 脉局灶缺血模型（MCAO），栓塞为永久性。参考ZeaLonga的方法在动物清醒后由协作者盲法评分进行行为学5 分制评分。 凡术中动物死亡、出现蛛网膜下腔出血、0分或者4分者， 均为模型制作失败，不纳入本实验，再随机补充病例，保 证实验动物每组数量不变。
Ref: 1. 1.Zhao H, et al. Journal of Neurochemistry. 2003, 85(4):1026-362-66. 2. 冯亦璞，等. 药学学报，1995; 30（10）: 741-745. 3. 崔丽英，等. 中国脑血管病杂志，2005; 2（3）: 112-115.
丁基苯酞对大鼠缺血脑组织 Bcl-2表达的影响
李其富 容琼文 何 俐
海南医学院附属医院神经内科 四川大学华西医院神经内科
背景
丁基苯酞（NBP）是我国研制的具有自主知识 产权的治疗急性缺血脑卒中的一类化学新药； NBP对缺血性卒中具有较佳的治疗保护作用， 涉及脑缺血病理的多个环节。
细胞凋亡是脑缺血损伤的重要组成部分，Bcl-2 基因是脑缺血神经元凋亡调控基因的重要组成 部分； Bcl-2是调节基因家族的基本成员，具有明显的 抑制细胞凋亡作用和神经保护作用。
2.NBP对Bcl-2表达的影响
缺血后Bcl-2上调的表达时限尚无统一认识，本研 究发现局灶性缺血72h， Bcl-2蛋白和mRNA水平 在梗死灶周围和海马区仍处于较高水平，NBP组 Bcl-2的表达更为明显。推测NBP能够上调Bcl-2的 表达水平和延长表达时限，其具体机制有待于进 一步研究 ； 梗死周围区Bcl-2表达最强，梗死核心区表达较弱 推测脑缺血时Bcl-2的表达可能必须具备缺血和细 胞轻度损伤两个条件，而一旦神经细胞损伤到 DNA崩解的程度，它们的合成也即停止。
目的
研究大鼠局灶性脑缺血时,给予NBP干预对内源 性Bcl-2和Bcl-2 mRNA表达的影响; 探讨NBP在大鼠缺血性脑损伤中的神经保护作 用可能的机制，为临床药物应用提供实验依据。
材料和方法
材料
实验动物
健康雄性SD大鼠60只，二级动物，3-4月龄，体重280g-350g， 成都中医药大学实验动物中心提供。
试剂及药品
NBP由石药集团恩必普药业公司提供，使用前用植物油稀 释10倍配成溶剂。 Bcl-2抗体和原位杂交试剂盒，武汉博士得生物技术有限公 司生产。 TTC，DAB显色试剂盒、P试剂盒、4%多聚甲醛及其它试 剂和药品由实验室提供。
实验方法（1）
建立大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO）
3天后SD大鼠
神经功能
缺损评分
实验方法 （4）
评价指标
神经功能缺损评分：Zea-longa 5分制评分法 梗死体积观察与测量：TTC染色
Bcl-2蛋白表达：采用SP免疫组织化学染色
Bcl-2 mRNA表达：采用原位杂交(POD)法
实验方法 （5）
结果判定
阳性细胞判定 免疫组化：阳性细胞的胞浆、胞膜、轴突着色呈棕黄色。 原位杂交：阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。 图象采集分析 Olympus显微照相系统采图，每只动物取梗死周围大脑皮 质、海马和梗死区保存较好部位，光镜下每个部位分析5个 视野。 image pro plus 5.02专业图象分析软件进行分析，采用积分 光密度值（IOD）进行统计学分析。
模型对照组
ISH×400
NBP组
讨论
1.NBP对神经功能评分及梗死体积的影响
本研究所采用Zea-Longa法建立大鼠MCAO模 型，其神经行为学、脑组织病理上接近临床， 适于脑缺血性卒中治疗实验研究。 本研究发现，与模型对照组相比，NBP在治 疗缺血后神经功能缺损和梗死体积在治疗组 均明显改善，与NBP前期研究结果相一致， 表明NBP对缺血卒中具有改善神经功能损害 的作用。
统计学方法
对所得数据用SPSS10.0软件包进行数据分析， 组间计量资料比较采用单因素方差分析（ oneway ANOVA ），计数资料采用秩和检验。 检验水准：P<0.05为有统计学意义。
结 果
1.神经功能缺损评分（NDS）
干预前NBP组和模型对照组 NDS比较P＝0.63 干预后NBP组和模型对照组 NDS比较P＝0.04
2.梗死体积比较
NBP组和模型对照组梗死体积比较 P <0.01。
3. Bcl-2蛋白表达
IOD
梗死周围区
海马区
梗死核心区
(积分光密度（IOD）值表示蛋白表达的相对强度，值越大表达越强) NBP组在梗死周围区和海马区，Bcl-2表达明显高于模型对照组（P<0.01） 在梗死核心区各组Bcl-2表达无显著性差异（P>0.05）
梗死周围区Bcl-2表达
模型对照组
IHC×400
NBP组
4. Bcl-2 mRNA表达
梗死周围区
海马区
梗死核心区
NBP组在梗死周围区和海马区，Bcl-2 mRNA表达明显高于对照组（P<0.01） 在梗死区各组Bcl-2 mRNA表达无显著性差异（P>0.05）
梗死周围区Bcl-2 mRNA表达
实验路线
造模 麻 醉 大 鼠 SD
仅行颈部血管分离而不栓塞
评分
分组
随机数字表
NBP组 （20只）
NBP灌喂3d 25mg/Kg, Bid 采集标本
பைடு நூலகம்
Zea-Longa法 1-3分
模型对照组 （20只） 假手术组 (20只）
相应剂量植物 油灌喂3d
实验方法 （3）
标本采集
处 死 取 脑
每组5只 TTC染色 免疫组化 15只多聚 甲醛固定 原位杂交
Ref: Longa EZ, et al. Stroke, 1989; 20(1):84-91.
手术操作图示
实验方法 （2）
动物分组
假手术组20只大鼠 （大鼠建立MCAO模型后，采用随机数字表法分组） 模型对照组和NBP组各20只。
动物处理
动物清醒后，假手术组、模型对照组（B、D组）予以食用植 物油灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后处死 。 NBP组予以NBP灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后 处死 。
采用稍加改良的Zea-Longa法，将SD大鼠制备为大脑中动 脉局灶缺血模型（MCAO），栓塞为永久性。参考ZeaLonga的方法在动物清醒后由协作者盲法评分进行行为学5 分制评分。 凡术中动物死亡、出现蛛网膜下腔出血、0分或者4分者， 均为模型制作失败，不纳入本实验，再随机补充病例，保 证实验动物每组数量不变。
Ref: 1. 1.Zhao H, et al. Journal of Neurochemistry. 2003, 85(4):1026-362-66. 2. 冯亦璞，等. 药学学报，1995; 30（10）: 741-745. 3. 崔丽英，等. 中国脑血管病杂志，2005; 2（3）: 112-115.
丁基苯酞对大鼠缺血脑组织 Bcl-2表达的影响
李其富 容琼文 何 俐
海南医学院附属医院神经内科 四川大学华西医院神经内科
背景
丁基苯酞（NBP）是我国研制的具有自主知识 产权的治疗急性缺血脑卒中的一类化学新药； NBP对缺血性卒中具有较佳的治疗保护作用， 涉及脑缺血病理的多个环节。
细胞凋亡是脑缺血损伤的重要组成部分，Bcl-2 基因是脑缺血神经元凋亡调控基因的重要组成 部分； Bcl-2是调节基因家族的基本成员，具有明显的 抑制细胞凋亡作用和神经保护作用。