分子生物学基因工程操作技术精选文档
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分 基因,这种基因叫做部分基因.思考：基因如何构建？
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一 个受体菌群中，那么，这剪去多余 位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点
如果用功能测定来筛选目R 一、 Total RNA——mRNA
部分
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
目的基因
6.1.1 目的基因的获取方法
1、目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___
主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链 DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA 复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突 变株不能进行DNA复制、修复和重组。
T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条 DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。 可接双链DNA的平末端、相容粘末端及其中的单链切口。
依据：目的基因的有关信息。 1 DNA转移过程中的几个概念
多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。 6、Cross-over PCR
如：根据基因的核苷酸序列 1）RNA指导的DNA聚合酶活力。
First round PCR 反转录：以RNA为模板，合成DNA。
6.2 基因表达载体的构建过程
AMP Amp
pBluscript SK 3.0 kb
Eco RI Plac
PgpdA /EcoR I
Plac Hygro
pPTH 6.5 kb
AMP
Eco RI
PgpdA
Nhe I TtrpC
Plac
Eco RI Hygro
RoAmy /Nhe I
PgpdA
pPTH-RoAmy 7.9 kb
TtrpC
Eco RI Eco RI RoAmy
EcoR I
AMP
pS K-PgpdA
4.5 kb
Pgpd
Plac
Not I
Hygro /Not I
AMP
pPH
Pgpd
5.8 kb
Plac Bam HI
H y g ro怎样从基因中得到我们所需的目 禽类成髓细胞瘤病毒（AMV)的反转录酶
检测目的基因是否导入受体细胞 基因工程基本操作的四个步骤
的基因？
目的基因的NA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 TG 诱导
破碎液 RoAmy1 (1.3 U/mL) RoAmy2 (0.5 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
BL21（DE3）
IPTG 诱导 破碎液
RoAmy1 (0.7 U/mL)
RoAmy2 (0.2 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
21 X
6.1 目的基因的获取
供体生物细胞
无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸双脂键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。
λ噬菌体载体－λ Zap cDNA 载体 1、模板（Templates）
3’---NGTC GACN---5’
取出DNA
主要包括质粒载体和病毒载体，使用的A载体
转染 真核细胞
表达生物 活性蛋白序列分析构建基因 体外基 因突变瞬时表达
稳定表达细胞系
定位、功能
表达产物 遗传修饰动物 功能研究
生产ห้องสมุดไป่ตู้ 性蛋白
例：米根霉a-淀粉酶基因的获取
R. oryzae genome DNA
Apm
PCR
RoAmy gene fragment
LacZ Eco RV
3、PCR原理之体外扩增条件
物理条件： 1、变性（Denaturation） 2、退火（Annealing） 3、延生（Extention）
化学条件： 1、模板（Templates） 2、引物（Primers） 3、dNTPs 4、DNA 聚合酶
PCR仪
4、RT-PCR（Reverse transcript）
基因重组（gene recombination）
是将不同基因片段连接起来构成一个新的DNA分 子的过程
自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建
有了目的基因，我们才能赋 予一种生物以另一种生物的 遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用
DNA连接酶（DNA ligase）---缝
DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演 一个既特殊又关键的角色，那就是把两条DNA黏合成一 条。无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA黏合酶都可 以借由形成磷酸双脂键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端 连在一起。
大肠杆菌DNA连接酶
对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片 段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应 形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
产物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用 1、模板（因片段，由于基因就是DNA分子，所以也称其为DNA克隆
Hin d Ⅲ
流感噬血杆菌种属
d株
第三种内切酶
识别位点常为回文结构 AATGAATTCGTACCG TTACTTAAGCATGGC
限制性核酸内切酶
切割DNA后有粘端与平端 之分或产生匹配末端
5’---NGAATTCN---3’ 3’---NCTTAAGN---5’
EcoR1
5’---NG
AATTCN---3’
TtrpC /BamH I
基因表达载体的组成
a、目的基因 位于基因的首端,是
b、启动子 RNA聚合酶结合位 点
c、终止子 位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
6.3 基因工程常用的工具酶
酶的种类
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶 I
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
（一）目的基因的获得
1. 用PCR技术获取基因 2. 用RT-PCR（因
6.4.1 PCR技术
1、PCR原理之DNA体内复制原理
2、PCR原理之DNA物理性质
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
pM D 1 9 -sim ple 2.7 kb
ori
Amp
pMD-RoAmy 4.4 kb
ori
EcoRI RoAmy
EcoRI
例：RoAmy在大肠杆菌中的表达
f1 ori NcoI
Kan RoAmy (1,2,X)
pET-RoAm y (1 ,2 ,X)
6.7 kb
NcoI
ori
LacI
BL21（DE3 condonplus）
3、将目的基因导入受体细胞
表达载体进入受体细胞稳定 表达，才能实现一种生物的 基因在另一种生物中的转化。
4、目的基因的检测与鉴定
才能确定目的基因是否真正 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
基因操作技术的基本原理和步骤
化学合成 酶切片段 RT-PCR 筛选目的基因连接载体 原核、真核 克隆、表达
在3'羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）---剪
识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同 构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源DNA， 保护自身DNA）
限制性核酸内切酶命名： 属名、种名、株名
基因工程（genetic engineering）
指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术， 或者指所有基因工程和基因工程相关技术
克隆（clone）
是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全 相同的子代群体
基因克隆（gene cloning）
指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另 一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群 完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所 以也称其为DNA克隆
T4 DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNARNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4Cl可 以提高大肠杆菌DNA连接酶的催化速率，而对T4 DNA连 接酶则无效。
无论是T4 DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都 不能催化两条游离的DNA链相连接。
反转录
cDNA (互补DNA）
DNA聚合酶 双链DNA
mRNA 反转录酶
cD端,是RNA聚合酶结合位点 感受态细胞（competent cell） mRNA只占总RNA的1%-5%。 依据：目的基因的有关信息。
功能
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子 或片段连接 ①合成双链cDNA的第二条键 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3'末端 以RNA为模板合成cDNA第一链
催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针
1. cDNA
❖ 以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转 基因特异性 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗
表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。 法除去RNA分子 基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因irst round PCR 位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点 PgpdA /EcoR I
分子生物学基因工 程操作技术
第6章：基因工程操作技术
大规模生产生物活性物质
天然细胞
天然细胞
分
离
酶
工
程
分离工程
基因工程 蛋白质工程
途径工程
工程细胞
酶工程
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
基本概念
基因操作（gene manipulating）
特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段） 的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间 的转移等多项技术
3’---NCTTAA
GN---5’
粘末端(Cohensive end or sticky end）5’突出端
5’---NCAG CTGN---3’ 3’---NGTC GACN---5’
Pvu 2
5’---NCAG CTGN---3’ 3’---NGTC GACN---5’
平末端 （blunt end）
例：米根霉a-淀粉酶基因的获取
基因的功能基因在染色体上的位置 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA中分离纯化。
（Brock p265 ）
基因的转录产物mRNA 转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。 基因翻译产物蛋白质 等特性。 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一 个受体菌群中，那么，这剪去多余 位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点
如果用功能测定来筛选目R 一、 Total RNA——mRNA
部分
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
目的基因
6.1.1 目的基因的获取方法
1、目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___
主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链 DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA 复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突 变株不能进行DNA复制、修复和重组。
T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条 DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。 可接双链DNA的平末端、相容粘末端及其中的单链切口。
依据：目的基因的有关信息。 1 DNA转移过程中的几个概念
多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。 6、Cross-over PCR
如：根据基因的核苷酸序列 1）RNA指导的DNA聚合酶活力。
First round PCR 反转录：以RNA为模板，合成DNA。
6.2 基因表达载体的构建过程
AMP Amp
pBluscript SK 3.0 kb
Eco RI Plac
PgpdA /EcoR I
Plac Hygro
pPTH 6.5 kb
AMP
Eco RI
PgpdA
Nhe I TtrpC
Plac
Eco RI Hygro
RoAmy /Nhe I
PgpdA
pPTH-RoAmy 7.9 kb
TtrpC
Eco RI Eco RI RoAmy
EcoR I
AMP
pS K-PgpdA
4.5 kb
Pgpd
Plac
Not I
Hygro /Not I
AMP
pPH
Pgpd
5.8 kb
Plac Bam HI
H y g ro怎样从基因中得到我们所需的目 禽类成髓细胞瘤病毒（AMV)的反转录酶
检测目的基因是否导入受体细胞 基因工程基本操作的四个步骤
的基因？
目的基因的NA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 TG 诱导
破碎液 RoAmy1 (1.3 U/mL) RoAmy2 (0.5 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
BL21（DE3）
IPTG 诱导 破碎液
RoAmy1 (0.7 U/mL)
RoAmy2 (0.2 U/mL) RoAmyX (0 U/mL)
21 X
6.1 目的基因的获取
供体生物细胞
无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸双脂键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。
λ噬菌体载体－λ Zap cDNA 载体 1、模板（Templates）
3’---NGTC GACN---5’
取出DNA
主要包括质粒载体和病毒载体，使用的A载体
转染 真核细胞
表达生物 活性蛋白序列分析构建基因 体外基 因突变瞬时表达
稳定表达细胞系
定位、功能
表达产物 遗传修饰动物 功能研究
生产ห้องสมุดไป่ตู้ 性蛋白
例：米根霉a-淀粉酶基因的获取
R. oryzae genome DNA
Apm
PCR
RoAmy gene fragment
LacZ Eco RV
3、PCR原理之体外扩增条件
物理条件： 1、变性（Denaturation） 2、退火（Annealing） 3、延生（Extention）
化学条件： 1、模板（Templates） 2、引物（Primers） 3、dNTPs 4、DNA 聚合酶
PCR仪
4、RT-PCR（Reverse transcript）
基因重组（gene recombination）
是将不同基因片段连接起来构成一个新的DNA分 子的过程
自然界不同生物之间的基因重组是经常发生的
基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建
有了目的基因，我们才能赋 予一种生物以另一种生物的 遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用
DNA连接酶（DNA ligase）---缝
DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演 一个既特殊又关键的角色，那就是把两条DNA黏合成一 条。无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA黏合酶都可 以借由形成磷酸双脂键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端 连在一起。
大肠杆菌DNA连接酶
对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片 段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应 形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
产物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用 1、模板（因片段，由于基因就是DNA分子，所以也称其为DNA克隆
Hin d Ⅲ
流感噬血杆菌种属
d株
第三种内切酶
识别位点常为回文结构 AATGAATTCGTACCG TTACTTAAGCATGGC
限制性核酸内切酶
切割DNA后有粘端与平端 之分或产生匹配末端
5’---NGAATTCN---3’ 3’---NCTTAAGN---5’
EcoR1
5’---NG
AATTCN---3’
TtrpC /BamH I
基因表达载体的组成
a、目的基因 位于基因的首端,是
b、启动子 RNA聚合酶结合位 点
c、终止子 位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
6.3 基因工程常用的工具酶
酶的种类
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶 I
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
（一）目的基因的获得
1. 用PCR技术获取基因 2. 用RT-PCR（因
6.4.1 PCR技术
1、PCR原理之DNA体内复制原理
2、PCR原理之DNA物理性质
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
pM D 1 9 -sim ple 2.7 kb
ori
Amp
pMD-RoAmy 4.4 kb
ori
EcoRI RoAmy
EcoRI
例：RoAmy在大肠杆菌中的表达
f1 ori NcoI
Kan RoAmy (1,2,X)
pET-RoAm y (1 ,2 ,X)
6.7 kb
NcoI
ori
LacI
BL21（DE3 condonplus）
3、将目的基因导入受体细胞
表达载体进入受体细胞稳定 表达，才能实现一种生物的 基因在另一种生物中的转化。
4、目的基因的检测与鉴定
才能确定目的基因是否真正 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
基因操作技术的基本原理和步骤
化学合成 酶切片段 RT-PCR 筛选目的基因连接载体 原核、真核 克隆、表达
在3'羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）---剪
识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同 构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源DNA， 保护自身DNA）
限制性核酸内切酶命名： 属名、种名、株名
基因工程（genetic engineering）
指所有涉及到DNA或者RNA操作的技术， 或者指所有基因工程和基因工程相关技术
克隆（clone）
是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全 相同的子代群体
基因克隆（gene cloning）
指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另 一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群 完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所 以也称其为DNA克隆
T4 DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNARNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4Cl可 以提高大肠杆菌DNA连接酶的催化速率，而对T4 DNA连 接酶则无效。
无论是T4 DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都 不能催化两条游离的DNA链相连接。
反转录
cDNA (互补DNA）
DNA聚合酶 双链DNA
mRNA 反转录酶
cD端,是RNA聚合酶结合位点 感受态细胞（competent cell） mRNA只占总RNA的1%-5%。 依据：目的基因的有关信息。
功能
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子 或片段连接 ①合成双链cDNA的第二条键 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3'末端 以RNA为模板合成cDNA第一链
催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针
1. cDNA
❖ 以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转 基因特异性 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗
表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化。 法除去RNA分子 基因定向突变（site-directed mutagenesis）是进行基因irst round PCR 位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点 PgpdA /EcoR I
分子生物学基因工 程操作技术
第6章：基因工程操作技术
大规模生产生物活性物质
天然细胞
天然细胞
分
离
酶
工
程
分离工程
基因工程 蛋白质工程
途径工程
工程细胞
酶工程
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
基本概念
基因操作（gene manipulating）
特定基因（被称为目的基因或外源DNA片段） 的制备、分离、鉴定、改造及其在不同生物间 的转移等多项技术
3’---NCTTAA
GN---5’
粘末端(Cohensive end or sticky end）5’突出端
5’---NCAG CTGN---3’ 3’---NGTC GACN---5’
Pvu 2
5’---NCAG CTGN---3’ 3’---NGTC GACN---5’
平末端 （blunt end）
例：米根霉a-淀粉酶基因的获取
基因的功能基因在染色体上的位置 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA中分离纯化。
（Brock p265 ）
基因的转录产物mRNA 转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。 基因翻译产物蛋白质 等特性。 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息