食管鳞癌患者来源移植瘤模型B-NDG小鼠与BALBc裸鼠的比较

2015年中国新诊断食管癌47.8万人，37.5万人死于食管癌，分别占2015年癌症新诊断人数和死亡人数的11.1%和13.3%［1］。

对于食管癌的治疗，手术仍是主要治疗方法［2］，大多数患者预后较差，5年生存率不到
20%［3］。

放、化疗仍是治疗食管鳞癌患者（ESCC ）的主流方法，然而药物有效率低且并发症大［4-6］。

近年来，以分子为靶标的治疗已发展成为食管癌中一种有希望的有
效治疗方法。

主要是抗EGFR 抑制剂［5］，很多药物仍处
于临床试验阶段，对于ESCC 患者是否安全有效仍有待评估。

因此建立模拟患者来源的ESCC 特异性的模型对临床前研究、药物评估、治疗和预后具有重要的转化意义。

目前已知的研究食管癌的动物模型不少，许多已进入主流研究平台［7-9］。

患者来源的移植瘤（PDX ）模型，PDX 模型是将患者手术切除的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，这不仅能够高度保留患者肿瘤组织的异质性、病理特征，还保存了肿瘤细胞间相互作用及肿瘤微环境［10］。

PDX 模型可以直接携带患者身上肿瘤靶标的
模型，并且药效反应与临床结果一致［11］
，因此PDX 模型对于ESCC 患者精准用药的筛选具有很大的优势。

目
Comparison of B-NDG ®and BALB/c mouse models bearing patient-derived xenografts of esophageal squamous cell carcinoma
GUAN Liuliu 1,2,ZOU Qingqing 1,2,LIU Qian 2,3,CHEN Size 1,2,31
Department of Oncology,3Scientific Research Center,First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University;2Guangdong Provincial Engineering Research Center for Esophageal Cancer Precise Therapy,Guangzhou 510080,China
摘要：目的探讨不同品系的小鼠对于食管鳞癌患者来源的异种移植瘤（ESCC PDX ）成瘤率的影响，为ESCC 的临床个体化治疗建立更优势的临床前动物模型。

方法收集22例ESCC 患者手术切除的肿瘤组织，分别利用B-NDG ®（NSG ）鼠和BALB/c 裸鼠来建立ESCC PDX 模型。

通过观察移植瘤成瘤情况，测量移植瘤体积，绘制生长曲线图，计算成瘤率和成瘤时间，HE 染色、免疫组化及基因组测序等实验，比较移植瘤组织与原患者肿瘤组织的一致性。

结果22例标本的PDX 模型移植结束，发现NSG 小鼠ESCC 肿瘤发生率（50%，11/22）高于BALB/c 裸鼠（18.18%，4/22）（P =0.027）。

NSG 小鼠的平均肿瘤成瘤时间为75.95d 短于BALB/c 小鼠的91.67d ，差异具有统计学意义（P <0.001）。

在NSG 小鼠和BALB/c 小鼠异种移植模型中，肿瘤均能保持病人ESCC 肿瘤组织的形态学特征。

基因分析结果显示，与BALB/c 裸鼠相比，NSG 小鼠肿瘤与亲代患者肿瘤样本间的基因相似度更高（P <0.0001）。

结论成功构建了NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠ESCC 皮下移植瘤模型，并发现NSG 小鼠对于模型成功的建立更具有优势。

关键词：NSG 小鼠；BALB/c 裸鼠；PDX 模型；食管鳞癌
Abstract:Objective To investigate the difference of tumor formation in different mouse strains bearing patient-derived xenograft of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and establish a better animal model for preclinical study of individualized treatment of ESCC.Methods The tumor tissues collected from 22ESCC patients were used to establish tumor-bearing mouse models in B-NDG ®(NSG)mice and BALB/c nude mice.The tumor formation rate and tumor formation time were compared between the two mouse models,and HE staining,immunohistochemistry and genome sequencing were carried out to assess the consistency between transplanted tumor tissues in the models and patient-derived tumor tissues.Results The tumor-bearing models were established successfully in both NSG mice (50%,11/22)and BALB/c nude mice (18.18%,4/22).The average tumor formation time was significantly shorter in NSG mice than in BALB/c nude mice (75.95vs 91.67days,P <0.001).In both of the mouse models,the transplanted tumors maintained morphological characteristics identical to those of patient-derived ESCC tumors.Genetic analysis showed that the xenografts in NSG mice had a greater genetic similarity to the patients'tumors than those in BALB/c nude mice (P <0.0001).Conclusion Mouse models bearing xenografts of patient-derived ESCC can be successfully established in both NSG mice and BALB/c nude mice,but the models in the former mouse strain can be more reliable.
Keywords:NSG mice;BALB/c nude mice;patient-derived xenograft model;esophageal squamous cell carcinoma
食管鳞癌患者来源移植瘤模型：B-NDG ®小鼠与BALB/c 裸鼠的比较
管柳柳1，2，邹晴晴1，2，刘倩2，3，陈斯泽1，
2，3广东药科大学附属第一医院1肿瘤科，3科学研究中心；2
广东省食管癌精准治疗工程技术研究中心，广东广州510080
收稿日期：2020-02-18
基金项目：广东省教育厅“创新强校”特色创新类项目（2017KTSCX104）；广州市科技计划项目（2018059）；越秀区科技计划项目（2017-WS-002）；广东省教育厅（广东普通高校重点项目）（2019KZDXM024)
作者简介：管柳柳，在读硕士研究生，E-mail:**********************通信作者：陈斯泽，博士，主任医师，E-mail:*****************.cn doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2020.08.19J South Med Univ,2020,40(8):1200-1206
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前为止，对于ESCC PDX模型的建立所用到的小鼠品系有：无胸腺裸鼠，严重免疫缺陷（SCID）小鼠［12-13］，非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠［14-15］以及敲除IL2Rγ的NOD/SCID小鼠（NSG/NOG）［16］，然而，不同小鼠品系之间ESCC肿瘤成功率差异较大［17］，但目前并未有不同小鼠品系之间建模成功差异的研究。

在本文研究中，使用了B-NDG®（NOD-Prkdc scid IL2rg tm1/Bcgen）（即NSG）小鼠，缺乏成熟的T、B 和NK细胞，相较于常用的NOD/SCID小鼠来说，NSG 鼠的免疫缺陷程度更高，适合人源细胞或组织的移植。

目前未有研究报道哪一种小鼠品系进行ESCC PDX模型的移植成功效率更高。

本研究使用NSG小鼠和BALB/c裸鼠建立ESCC PDX模型，通过比较肿瘤成瘤率，肿瘤成瘤时间，肿瘤的病理特征及基因表达，在NSG 小鼠和BALB/c小鼠之间选择更优的小鼠品系来建立ESCC PDX模型，这将为以后食管癌个体化治疗及药物筛选提供更好的基础。

1资料和方法
1.1实验动物
雌性4~6周龄NSG小鼠［百奥赛图，SCXK（苏）2016-0004）］，体质量17~20g。

雌性4周龄BALB/c裸鼠购于广东省医学实验动物中心［实验动物合格证：SCXK（粤）2018-002］。

饲养于屏障环境下，SPF级，湿度30%~50%，室温20~22℃。

予以经过钴-60辐照灭菌的SPF级小鼠饲料饲养，3~4d换1次垫料。

1.2标本选择
22例ESCC标本来自广东省人民医院及广东药科大学附属第一医院胸外科经手术治疗的病人，自2017年9月至2020年1月的22例患者，标本搜集均获得患者知情同意。

纳入标准：①ESCC初治患者，术前未行化、放疗等相关治疗；②组织病理结果提示为ESCC；③提供的新鲜组织标本大小合适且质地较好。

排除标准：①5年内患有其他肿瘤疾病；②术前已进行ESCC相关治疗。

1.3ESCC PDX小鼠模型的建立
将患者手术切除的ESCC肿瘤组织存放于磷酸盐缓冲液（PBS）中，在30~60min内冰上运送至动物中心进行移植，用无菌器械将肿瘤切碎成约10~20mg的组织块，在小鼠下肢背部用70%酒精消毒并剪一小缺口，将切碎的组织块（10~20mg）塞入小鼠皮下，按压约2~ 3min防止组织块漏出。

每例标本接种3~5只小鼠。

当形成异种移植物时，我们将这些肿瘤定义为P1代，一旦P1代肿瘤达到1000mm3，取下肿瘤，进行下一代移植，此为第2代小鼠，定义为P2，依此类推。

所有动物实验均得到广东药科大学附属第一医院动物护理和使用委员会的批准。

整个实验在无菌条件下进行。

从肿瘤接种到肿瘤生长至体积约为250mm3所用时间定义为成
瘤时间。

如果在4个月内肿瘤体积长至1000mm3，则表明该模型成功。

1.4观察与计算公式
移植后每3d定期观测小鼠的活动状态，监测小鼠体重变化及肿瘤生长情况。

通过游标卡尺每周2次测量肿瘤的大小，公式：（最长半径×最短半径2）/2［18］。

1.5HE染色
将小鼠颈椎脱臼后取下肿瘤，取部分放于4%多聚甲醛中固定24h，然后常规石蜡包埋，6μm厚度连续切片，脱蜡脱水后用苏木精染液染色3~5min。

水洗反蓝，依次置于85%、95%的梯度酒精脱水后，放入伊红染液中染色3~5min。

随后，用无水乙醇脱水和二甲苯透明并封片。

1.6免疫组化
切片2次二甲苯脱蜡后，无水乙醇不同浓度梯度（100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精）脱水，将切片置于柠檬酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH6.0）中，将抗原回收溶液在高压锅中煮沸3min。

然后用5% BSA封闭，置于37℃温箱0.5h，后将切片与一抗在4℃孵育过夜（Ki-671∶500，P531∶500）。

然后，将切片与二抗（HRP标记）一起室温孵育1h，并用DAB染色。

最后，将切片用苏木精复染，脱水，然后固定。

1.7RNA测序
从组织中提取总RNA，获取mRNA方式：一是通过Oligo（dT）磁珠富集带有polyA尾的mRNA（真核生物），二是从总RNA中去除核糖体RNA，从而得到mRNA（原核生物）。

以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下,以dNTPs为原料合成cDNA 第二条链。

纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库，把构建好的文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。

1.8统计分析
使用SPSS22.0软件分析所有数据。

用卡方检验评估移植瘤成瘤率率与临床病理参数之间的关系。

采用t检验比较NSG小鼠组和BALB/c裸鼠组成瘤率和成瘤时间，当P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2结果
2.1组织标本基本情况
本研究收集22例ESCC组织标本，其中，第1号病例即为ES01，第2号病例为ES02，以此类推。

22例病例包括年龄在45~78岁之间的男性17例，女性5例，病例
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中位数年龄为67岁。

Ⅰ期1例，Ⅱ期9例，Ⅲ期12例，Ⅳ期0例。

对ESCC 癌患者临床参数（年龄、性别、病理分期、分化程度和淋巴转移情况）与NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠移植瘤模型是否成功进行统计学分析，如表1，结果显示：年龄、性别、病理分期、分化程度及淋巴转移这些因素与NSG 小鼠移植瘤成瘤率无明显相关性。

在
BALB/c 裸鼠中，年龄、性别、病例分期、分化程度与BALB/c 裸鼠移植瘤成瘤率无明显相关，淋巴结转移情况对BALB/c 裸鼠的移植瘤成瘤率有显著影响（P =0.03）。

2.2NSG 小鼠P1代模型成瘤情况
表1ESCC 患者临床资料与NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠移植瘤模型成瘤率的统计描述
Tab.1Relationship between clinical characteristics of ESCC patients and tumor formation rate of NSG mice and BALB/c nude mice xenograft models P value:Success vs Failure.
Factors Age （year ）≥60<60Gender Male Female Staging Ⅰ-ⅡⅢ-ⅣDifferentiation Poor
Moderate-poor Moderate High
Lymphnodemetastasis Yes No
101
74
47
2341
47
40
22
13
0310
13
74
101
65
1263
65
115
153
99
3294
99
Total
175
175
1012
35104
1012
58.82%20%
41.18%80%
40%58.33%
66.67%60%40%25%
40%58.3%
23.53%0%
11.76%40%
10%25%
0%60%
10%0%
10%25%
0.853
0.139
0.412
0.326
0.416
0.456
0.104
0.174
0.371
0.03
22例患者标本接种到NSG 小鼠后背部皮下，其中
有11例标本的P1代小鼠移植瘤在4个月内体积可约达1000mm 3，提示移植瘤成功，NSG 小鼠P1代移植瘤成瘤率为50%（11/22）。

在移植后平均75.95d ，移植瘤体
积可达到250mm 3大小，即NSG 小鼠P1代成瘤时间平均为75.95d 。

成瘤生长曲线如图1。

1200800
400
00
20
40
60
80
100
120
Time after tumor transplantation (day)
T u m o r v o l u m e (m m 3)
ES02
20
40
60
80
Time after tumor transplantation (day)
T u m o r v o l u m e (m m 3)
1200
800
400
0ES13
图1NSG 小鼠肿瘤生长曲线
Fig.1Tumor growth curve in NSG mice.A :The growth curve of ES13NSG mice with the earliest tumor formation in P1generation (n =4);B :The growth curve of ES02NSG mice with the latest tumor formation in P1generation (n =4).
A
B
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图2BALB/c 裸鼠肿瘤生长曲线
Fig.2Tumor growth curves in BALB/cmice.A :The growth curve of ES05BALB/c nude mice with the earliest tumor
formation in P1generation (n =5);B :Growth curve of ES02BALB/c nude mice with the latest tumor formation in P1generation (n =4).
1200800
400
00
20
40
60
80
100
120
140
Time after tumor transplantation (day)
T u m o r v o l u m e (m m 3)
ES02
1200
80040000
20
40
60
80
100
120
Time after tumor transplantation (day)
T u m o r v o l u m e (m m 3)ES05
A
B
图3NSG 小鼠与BALB/c 裸鼠成瘤情况比较
Fig.3Comparison of ESCC tumor formation between NSG mice and BALB/c nude mice.A :Average tumor formation time of NSG mice and BALB/c nude mice;B :Tumor formation rate of NSG mice and BALB/c nude mice (NSG:50%,BALB/c:18.18%);C :Growth curve in NSG mice and NALB/c nude mice with ES05patient tumor;D :The pictures of NSG mice and NALB/c nude mice with tumors.P values were calculated using an unpaired two-tailed Student's t test,***P <0.001.
NSG BALB/c
D a y s b d f o r d t u m o r r o l u m n o f 250m m 3
120100806040
***
NSG
BALB/c
2520151050
N u m b e r o f P X D m o d e l
Transplant failure Transplant success
NSG BALB/c
120010008006004002000T u m o r v o l u m e (m m 3)
20406080100120
Time after tumor transplantation
(day)
A
B
C
D
2.3BALB/c 裸鼠P1代模型成瘤情况
22例患者标本接种到BALB/c 裸鼠后背部皮下，其中有4例标本的P1代小鼠移植瘤在4个月内体积约达1000mm 3，提示移植瘤成功，BALB/c 裸鼠P1代移植瘤成瘤率为18.18%（4/22）。

在接种平均91.67d 后，移植瘤体积可达到250mm 3大小，即NSG 小鼠P1代成瘤时间平均为91.67d 。

成瘤生长曲线如图2。

2.4NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠成瘤情况的比较
在不同宿主小鼠中，NSG 小鼠P1代肿瘤长至250mm 3平均需要75.95d ，比BALB/c 裸鼠（平均91.67d ）所需时间更短（P <0.001）。

NSG 鼠的成瘤率（50%）高于BALB/c 裸鼠（18.18%），差异具有统计学意义（P =0.027）。

在BALB/c 裸鼠移植成功的原代病人肿瘤组织标本在NSG 小鼠中均能够成瘤，且同一例组织标本在NSG 小鼠体内的成瘤时间明显快于BALB/c 裸鼠（图3）。

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2.5P1代NSG 小鼠与BALB/c 裸鼠模型移植瘤的病理学检查
H&E 染色结果显示，与原匹配的患者肿瘤组织相比，NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠P1代移植瘤的病理形态
均与患者组织形态相似。

免疫组化Ki67和P53染色结
果也表明，NSG 与BALB/c 小鼠P1代移植瘤与患者肿瘤组织均有相似阳性表达（图4）。

图4患者肿瘤组织与P1代NSG 小鼠，BALB/c 裸鼠组织病理学检测
Fig.4Histopathology results of patient tumor tissues and tumor tissues in P1of PDX models (HE staining and immumohistochemicalstaining of Ki67and P53).Slides were stained with H&E and images were captured at ×400.AOD:Average optical density.NS:No
significance.
Patient
P1NSG P1BALB/c
P 53K i -67H E
A (P 53)0.6
0.50.40.30.20.1
Patient
P1NSG P1BALB/c
NS NS
A (K i -67）
0.93
0.920.910.900.890.880.870.860.850.840.830.82
Patient
P1NSG
P1BALB/c
NS
NS
2.6P1代NSG 小鼠与BALB/c 裸鼠模型移植瘤的基因测序
与亲代患者肿瘤基因突变数相比，NSG 小鼠PDX 模型与患者肿瘤重合基因数为98.34%，BALB/c 裸鼠PDX 模型与患者肿瘤重合基因突变数为83.34%（图5）。

测序结果表明NSG 小鼠的肿瘤与原代患者肿瘤间的基因相似度更高（图6）。

3讨论
ESCC 是一种高度侵袭性肿瘤，晚期患者预后较差，治疗方法有限。

因此，开发有效的临床前的模型迫在眉睫。

本研究探索不同品系小鼠对动物模型的影响因素，对构建成瘤率更高，成瘤时间更短的临床前PDX 动物模型具有重要意义，为ESCC 患者的个体化治疗及
药物研究评估与筛选提供了良好的平台。

PDX 模型能稳定地保持原代肿瘤中的病理特征、
肿瘤微环境和异质性［19］
，成为药物开发的优选的临床前
工具［20］
，但其移植成功率和小鼠品系相关。

不同小鼠品系免疫缺陷程度不同。

常用的免疫缺陷鼠有：NOD/SCID 小鼠，缺乏几乎所有类型的免疫细胞；其次是缺乏B 细胞和T 细胞的SCID 小鼠；然后是无T 细胞的无胸腺
裸鼠［21］。

近几年出现了一种新的免疫缺陷鼠（NSG 鼠），小鼠体内功能性T 细胞B 细胞缺失及NK 细胞活性丧失，从而导致包括天然杀伤细胞分化在内的许多先天免
疫功能异常［22-23］。

本实验是将ESCC 患者术中切除获取的新鲜肿瘤组织，接种到宿主NSG 小鼠或BALB/c 裸鼠
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背部皮下，来比较品系不同的鼠种对异种移植模型的影响。

我们的结果显示，NSG 小鼠的成瘤率为50%，与先
前的报道34%~54%基本一致［12,15,24］
，而BALB/c 裸鼠的成瘤率仅为18.18%，两者差异具有统计学意义（P =0.027）。

相比较BALB/c 裸鼠，我们发现NSG 小鼠不仅成瘤率更高，在成瘤时间方面也更有优势，NSG 小鼠（平均75.95d ）明显优于BALB/c 裸鼠（平均91.67d ），因为NSG 小鼠属于T 、B 、NK 细胞联合免疫缺陷动物，是鼠种中免疫缺陷最为严重的品种，因而更容易接受异体移植。

BALB/c 裸鼠仅为单一T 淋巴细胞功能缺陷，BALB/c 裸鼠体内存在的B 细胞和NK 细胞发挥了一定的筛选作用，会导致
BALB/c 裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强［25-26］
，降低了成瘤率，延长了成瘤时间，进而影响ESCC 肿瘤皮下移植瘤模型的建立。

本研究还发现，在与原组织的匹配度上，NSG 小鼠表现出了巨大优势，RNA 测序结果显示，NSG 小鼠的移植瘤与亲代的肿瘤突变基因重合数为98.34%，而BALB/c 裸鼠与亲代肿瘤的突变基因重合数只占83.34%。

基因测序结果也发现NSG 小鼠移植瘤与原代患者组织的一致性更高。

这表明，NSG 小鼠比BALB/c 裸鼠更适合进行ESCC PDX 模型的建立。

不足在于构建PDX 模型需要大量小鼠，而NSG 小鼠价格昂贵，虽然成瘤时间相比BALB/c 有明显优势，但所需时间仍较
长。

尽管如此，由于PDX 的独特性和如上所述的许多优势，它仍然被认为是值得临床前使用的工具。

本实验统计分析结果显示，移植模型的成瘤率与患者的年龄（NSG ：P =0.853，裸鼠：P =0.456）、患者的性别（NSG ：P =0.139，裸鼠：P =0.104）无显著性差异。

与患者临床病理分期没有明显关系（NSG ：P =0.412，裸鼠：P =0.174）。

在淋巴结转移情况中，出现了不同的结果，NSG 显示无显著性影响（P =0.416），BALB/c 有显著影响（P =0.03）。

经调查发现，Kim 等［27］用102例手术切除的胰腺癌标本建立了PDX 模型，通过多变量分析，发现患者的肿瘤移植成功率与肿瘤分化，淋巴结转移等因素无关。

然而，有部分研究者的实验数据表明组织移植成功率与患者肿瘤分化，淋巴转移有联系，认为肿瘤组织的恶性程度越高，侵袭力越大，肿瘤组织更易于适应环
境，成瘤率更高［28-29］。

还有学者认为移植成功率与肿瘤
复发时间有关［30］
，肿瘤复发时间在一定程度上代表该肿瘤的恶性程度，肿瘤复发时间越短，恶性程度越高，移植成功率更高。

还有很多与PDX 模型的移植成功率相关的其他因素，包括不同的肿瘤类型、肿瘤离体时间，肿瘤大小，移植部位等等，因此对于PDX 模型的建立仍需要不断探索，大量样本的实验验证必不可少。

图6RNA 测序验证ES02例组织标本与P1代NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠PDX 模型之间的一致性
Fig.6Consistency between ES02patient'tumor tissue and P1tumor tissue of PDX models in NSG mice and BALB/c nude mice by RNA sequencing.R 2is closer to 1,the degree of consistency is higher.
0.00.4
0.8 1.2
Patient
1.2
0.8
0.4
B A L B /c
R 2=0.7P <0.0001
0.0
0.4
0.8
1.2
Patient
N S G m o u s e
1.2
0.80.4
0R 2=0.9833P <0.0001
A
B
图5ES02例P1代NSG 小鼠和BALB/c 裸鼠与患者肿瘤组织重合基因突变数的比较
Fig.5Gene sequencing results of patient tumor tissues and P1of PDX models tumor tissues.Blue:Patients'tumor gene mutations.Yellow:P1tumor gene mutations of ESCC PDX models in NSG mice.Grey:P1tumor gene mutations of ESCC PDX models in BALB/c nude mice.
A
B
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ESCC 是一种高度侵袭性肿瘤，晚期患者预后较差，治疗方法有限。

因此，开发有效的临床前的模型迫在眉睫。

本研究探索不同品系小鼠对动物模型的影响因素，对构建成瘤率更高，成瘤时间更短的临床前PDX 动物模型具有重要意义，为ESCC 患者的个体化治疗及药物研究评估与筛选提供了良好的平台。

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（编辑：吴锦雅）
J South Med Univ,2020,40(8):1200-1206
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