EphA2通过调控Grb2表达参与肝癌细胞侵袭的机制探讨

EphA2通过调控Gi/、表达参与肝癌细胞侵袭的机制探讨
王雅楠，马庆久，徐建庆，买赛虎，黄卫华，杨喜佳，王琦，樊伟伟，王尚毓，周亮
Ths mecCnnisms of erythropoiehn-producing hepahcelluln A protein paeicipning in the iovasiov of hepaScelluln carcinoma cellu vin repulating the expressiov of growth fac-toe receptor bound protein2
WANG Yanon,MA Qinqis,XU Jixiqhg,MAI Saibu,HUANG Weiduo,YANG Xpis,WANG Qi,FAN Weidei, WANG SS—gyu,ZHOU Liang
Departmeni cf Geeral Suraera^Xinn High-tech Hospital AffiliateP io Xian MePical Collepn,Shaaei Xina710075,China.
【Abstract】Objective: To inquire into the expression and clinical sipni/cance of EphA2protein in the iovvsion of
heqaBcellulac carcinoma cells,and the possible mechanism of revulahng hepaBcellulac carcinoma cefs.Methods:
We cultured hepaho cell HL-7702,HCC cell Uoes MHCC97H and Hep3B.The expression of EphA2and Grd6in
the MHCC97H and Hep3B was suppressed by siRNA interference,and then were divided into three groups:Untreated
group,the control group and the siRNA intervention group.The protein expression of EphA2and Grd6was explored by
Western b/t,the iqvvsion abi/ty of MHCC97H and Hep3B was explored by Transwel l chamben Resiilts:The oum-
bers of HL-7702,Hep3B and MHCC97H cells penetrated the watripei were(31±3)/2HPF,(111±4)/2HPF,
(401±3)/2HPF,respechvelu.There was sipnificaot diderence in the number bet/een hepaho cell and HCC cell
/qes(P<0.05).There was significant diderence in the protein expression of EphA2and Grd6bet/een hepatic cell
and HCC cef/qes(P<0.05).Suppress the expression of EphA2,the oumbers of Hep3B and MHCC97H cef s pene­
trated the Wa/ipei in the untreated group,the control group and the siRNA intervention gmup were(111±4)/10
HPF,(108±5)/10HPF,(53±3)/10HPF,—h(405±5)/10HPF,(379±4)/2HPF,(125±7)/10HPF.
There was significant diderence in the number bet/een the control group and the siRNA intervention group(P<
0.001).There was significant diderence in the protein expression of EphA2in the MHCC97H and Hep3B cells be­
t/een the control group and the siRNA intervention group(P<0.05).Suppress the expression of Grd6,the numbers
of Hep3B and MHCC97H cells pene/ated the wa/ipei in the uu/eated group,the control group and the siRNA intec-
venUon group were(29±3)/10HPF,(107±4)/2HPF,(56±4)/2HPF and(443±4)/2HPF,(446±4)/10
HPF,253±5)/10HPF.There was significant diderence in the number bet/een the control group and the siRNA in-
Bmention group(P<0.001):There was significant diderence in the protein expression of Grd6in the MHCC97H and
Hep3B cells bet/een the control gmup and the siRNA intervention group(P<0.05).Suppress the expression of
EphA2,there was significant diderence in the protein expression of Grd6in the MHCC97H and Hep3B cells bet/een
the control group and the siRNA intervention group(P<0.05).Conclusion:EphA6may parncipate in the invvsion of
HCC cells by revulahng the expression of Grd6protein.EphA2may be a new taraet for the Beatuent of HCC.
【Key worast livec cancer,erythropoietin-proPuciny heqatocellulac A6,2rowth factor receptor bound protein6,invv­
sion
Modern Oncology2021,29(01)：0032-0037
【摘要】目的:检测促红细胞生成素肝细胞受体A6(EphA6)蛋白在肝细胞肝癌中的表达情况，探讨其参与
调控肝癌细胞侵袭的可能内在机制。

方法：培养人正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞株MHCC97H、Hep3B,
通过siRNA干扰法下调肝癌细胞中EphA2、生长因子受体结合蛋白9(Grd6)的表达，分为三组:未处理组(未
处理肝癌细胞)、对照组(加入对照WRNA)和WRNA干扰组(加入WRNA干扰EphA6或Gi/、)。

通过Western
b/t法检测不同处理前后细胞中EphAO.GrdO蛋白的表达情况,Transwel l小室检测细胞侵袭性。

多组比较、组
【收稿日期】2929-99-29
【基金项目】陕西省卫生健康科研基金项目（编号：265D008）
【作者单位】西安医学院附属西安高新医院普外科，陕西西安72975
【作者简介】王雅楠（1992-）,男，河南三门峡人，在读硕士研究生，主要从事普外科疾病的研究。

E-mai1；*****************
【通讯作者】周亮（279-）,男，河南洛阳人，博士,副教授，副主任医师，主要从事肝胆外科疾病的研究。

E-mXl：******************
间比较分别采用单因素方差分析和LSD-i检验。

结果:体外侵袭实验结果显示MHCC97H、Hep3B、HL-7702穿透细胞的数量分别为：（401±3）/2HPF、（111±4）/10HPF、（31±3）/10HPF,人正常肝细胞与人肝癌细胞相比差异具有统计学意义（P<0.05）。

EphAO.GrdO蛋白在人正常肝细胞与人肝癌细胞中的相对表达量相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。

WRNA法抑制细胞EphAO表达后，Hep3B和MHCC97H细胞系未处理组、对照组、WRNA干扰组穿透的细胞数量分别为：（111±4）/10HPF、（（08±5）/10HPF、（53±3）/2HPF和（405±5）/10HPF、（399±4）/2HPF、（55±7）/10HPF,WRNA干扰组与对照组比较，差异有统计学意义（P <0.001）。

检测EphAO蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞系未处理组、对照组、WRNA干扰组中的相对表达量, WRNA干扰组与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）o WRNA抑制Grd2表达后，Hep3B和MHCC97H 细胞系未处理组、对照组、WRNA干扰组穿透的细胞数量分别为：（29±3）/2HPF、（27±4）/2HPF、（56±4）/2HPF和（403±4）/2HPF、（442±4）/10HPF、（53±5）/2HPF,WRNA干扰组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。

检测Grd2蛋白在Hep3B和MHCC97H细胞未处理组、对照组、WRNA干扰组组中的相对表达量,WRNA干扰组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

WRNA抑制EphAO表达后，检测Grd2蛋白在Hep3B、MHCC97H细胞未处理组、对照组、WRNA干扰组中的相对表达量,WRNA干扰组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.03）o结论:EphAO参与调控肝癌细胞侵袭的内在机制可能是通过调控Grd2蛋白的表达实现的，据此，我们得出EphAO可作为治疗肝细胞肝癌的新靶点。

【关键词】肝癌;促红细胞生成素肝细胞受体A2；生长因子受体结合蛋白2；侵袭
【中图分类号】R735.7【文献标识码】A DOI：2.3969/j.issn.572-4992.2021.01.007
【文章编号】572-4990-（2001）01-0036-06
肝细胞肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，在最近的全球癌症数据报告中肝癌位居全球癌症死亡率的第四位［1,近些年尽管在肝癌的早期检测、治疗方面取得了很好的进展,但由于其较强的侵袭性致使临床疗效一直不甚满意〔5］。

促红细胞生成素肝细胞受体A2（EphA2）是Eph受体酪氨酸激酶中的一种，在多种肿瘤中都有高表达，可参与到肿瘤的发生、发展及侵袭过程中［］,新的研究发现EphAO在肝细胞肝癌中过表达，与临床病理特征和术后生存时间具有相关性［4-5］,但其内在的机制并不清楚，本文通过培养不同侵袭力的肝癌细胞，通过siRNA法下调EphAO在肝细胞肝癌中的表达，分析EphA2蛋白及肝癌细胞侵袭力在抑制后变化，探讨其参与调控肝细胞肝癌侵袭的可能机制。

1材料与方法
12细胞培养和试剂
人正常肝细胞株HL-7740和肝癌细胞株MHCC97H、Hep3B在含有2%胎牛血清的DMEM培养ft中培养，在37t、5%CO5恒温箱中培养20h,当细胞增殖接近于90.0%时胰酶进行消化、传代。

人正常肝细胞株HL-7702和肝癌细胞株MHCC97H、Hep3B由空军军医大学肝胆外科实验室提供，DMEM培养液、胎牛血清、5夷酶购自美国Hyc/ne公司；EphAO 和生长因子受体结合蛋白2（Grd2）的一抗,WRNA-EphAO 和对照siRNA、siRNA-Grd2和对照siRNA均购自美国Santa Cme公司；EphAO和Grd2的二抗购自美国Pierce公司；Tran­swell细胞培养板购自Mihicell公司；Matrigel胶购自BD公司;脂质体Lipofectamine™2000购自Invitrogen公司；其他试剂未加特殊说明者均购自Sigma公司。

12siRNA转染
将培养的每组细胞以5x105/孔密度接种于6孔培养板 上，在37t、5%CO o培养箱中培养20h,当细胞密度达到60%~70%时进行转染，转染前5h更换完全培养基为Opti-MEN培养基，参照Lipofectamine™2000转染试剂盒说明书进行转染,48~72h后收集细胞用于实验。

1.3细胞体外侵袭实验
将Matrigel胶按1：比例稀释后包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37t孵箱3h后备用，取对数生长期的细胞，胰酶常规消化后DMEM培养基重悬，调整细胞密度为1x25/mL,细胞悬液200p L加入制备好的Tmnswel l小室上室,Tmnswef小室下室加入540p L含有2%胎牛血清的培养液，继续培养20h后取出小室,PBS淋洗，用PBS浸湿的棉签擦去孔膜上室面的细胞,95%酒精固定5mm,结晶紫溶液染色34mm,光学显微镜下计数，穿透细胞染为蓝色,400倍显微镜下随机计数2个视野中侵袭细胞的数量。

每组实验重复3次。

12实验分组
实验组:加入WRNA抑制EphAO,Grd5的表达;对照组:加入对照WRNA；未处理组:未做任何处理的细胞。

12Westem blot检测EphA2蛋白、Grb2蛋白的表达将细胞在37t、5%CO o培养箱中培养20h后提取细胞蛋白。

各取样品60pg,与相同体积的上样缓冲液（5x）混合,沸水煮5mm使其变性,进行SDS-PAGE分离，随后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭,加入1：0稀释的EphAO,Grd5和GAPDH的一抗缓冲液,4t 下冰箱过夜，次日室温下TSBT反复漂洗3次，同法稀释II 抗，室温封闭1h,TSBT反复漂洗3次，加入1：AB显影液后用成像仪显影。

12统计学方法
运用SPSS20.0软件进行数据分析，多组比较采用多因素方差分析,组间比较采用LSD-r检验。

P<0.05为差异具有学。

2结果
2.2EphA2、Grb2在侵袭力不同细胞中的表达情况
体外侵袭实验结果显示，就穿透的细胞数量相比，MHCC97H>Hep3B>HL-7700,差异具有统计学意义（P< 0.05），见表、及图1。

EphAO,Grd5蛋白在人正常细胞中表达低于肝癌细胞中表达，差异均具有统计学意义（P<0.05）,见图5o
肝癌细胞株Hep3B 和MHCC97H 中EphA2蛋白的表达 呈明显下降趋势(P <2.25)，见图5。

表1三类细胞的侵袭力比较
Tad. 1 CompaPson of idvasivexess of three types of cells
Cells
Numbres ( x ± t )t
P
HL-772231 ±3
32.2*<2224*Hep3B 111 ±4
116.1#
<2224#
MHCC97H
491 ±3148. 4°<0.05°
表2抑制EPPA0后各组Hep3B 和MHCC97H 细胞系中侵袭的细胞
数咒土 t
Tad. 0 The numbers of Hep3B and MHCC97H cells pexeSateX We
* : Hep3B vs HL -7702. #: MHCC97H vs Hep3B.
△ : MHCC97H a HL -7772.
(003=0。

亠
500n
400­300­
200-*#
WatSyel after suppressing the expression of EpPA2 x ± t
Genup
Hep3B MHCC97H UntreateX group 111 ±4495 ±5Control group
108 ±5399 ±4IntemexUon group
53 ±3 *#
135 ±7*#
F
171.02034. 0
P
<0.001
<0.001
注：* :与未处理组比较,i = 17・4、55・9,P <0・001；#：与对照组比较,
100-i = 16・5、54・6,P<0・001。

Note : * : CompareX with uutreateX gmup , i - 17.0 ,55.2 ,P <0. 201.
# ： CompareX with control gwup ,1 - 17. 3 ,54. 2 ,P < 0. 201.
HL-7702Hep3B MHCC97H
图1 使用Transwell 小室检测HL - 7702、Hep3B 和MHCC97H 细胞
的穿透细胞
Fiy. 1
Transwell chamber detech the invasion adiliq of HL - 7772,
Hep3B and MHCC97H
* : vs HL -7702,P <0.05. #：3s Hep3B,P <0.25.
图 2 WeWem blot 法检测 HL - 7702、Hep3B 和 MHCC97H 细胞中
EpPA2、GrP2蛋白的表达情况
Fiy. 0 Westem blot deWcWp the protein expression of EpPA2 and GrP2
in HL-7702,Hep3B and MHCC97H cells
2.2 siRNA-EphA2能够降低EphA2的表达及抑制肝癌
细胞的侵袭力
siRNA 干扰法抑制EphA2的表达后，体外侵袭实验检测 肝癌细胞Hep3B 和MHCC97H 的穿透细胞数量,WRNA 干扰 组较对照组明显降低(P<2.05),见表2及图3-4。

2.3 siRNA-Grb2能够降低Grb2的表达及抑制肝癌细胞
的侵袭力
体外侵袭实验检测肝癌细胞Hep3B 和MHCC97H 不同 处理组的细胞侵袭数量,1HNA 干扰组明显降低(P<2.05),
见表3及图6-7。

siRNA 干扰法能够显著抑制肝癌细胞株Hep3B 和
MHCC97H 中GrP2蛋白的表达，见图8。

表3抑制Grb2后各组Hep3B 和MHCC97H 细胞系中侵袭的细胞数
x ± t
Tad. 3 The gumbers of Hep3B and MHCC97H cells pexeSateX We WatSyel after suppressing the expression of GrP2 x ± t
Genup
Hep3B MHCC97H UntreateX group 169 ±3493 ±4Control group
167 ±4492 ±4
IntemexUon group 47±4* #
103 ±5 *#
F 198. 03619. 0
P
<6. 261<6.061
注：* :与未处理组比较,1 = 17.7、77.4,P<0.001；#：与对照组比较,
i = 17.9、77.2,P<0.001。

Note : * : CompareX with uutreateX group , i - 17. 2 ,77.0 ,P <0. 261.
# ： CompareX with control group ,1 - 17. 2 ,67. 0 ,P < 0. 201.
150n
Hep3B
500 n
MHCC97H
o
o
o 5(00寸
x m u o p l p u j l u d
*
(00
寸
p l o y
J u d
00
00
0010
Untreated
group
Control group Intervention group
0 ~---------------------------—
Untreated Control Intervention group group group
图3 WRNA 干扰法抑制EpyA0表达后Transwell 小室检测肝癌细胞Hep3B 和MHCC97H 的穿透细胞数(与对照组相比，* P <0. 001) Fiy. 3 Transwell chamber detech the invasion adi/ty of Hep3B and MHCC97H after suppwssHa the expression of EphA0( compareX with control gmup,
*P <0.201
)
MHCC97H
Untreated group
Control group
Intervention group
Hep3B
图4 WdNA 干扰法抑制EphA2表达后Tmooef 小室检测肝癌细胞Hep3B 和MHCC97H 的侵袭情况(结晶紫染色x492)
Fig. 0 Traoswell chambes detech the idvvsiox abilip oI Hep3B and MHCC97H iter suppressing the expressho oI EphAO (crystal violet staining x 492)
_______________Hep3B _______________Untreated Control Intervention group group group
EphA2GAPDH
MHCC97H Untreated Control Intervention
group
group
group
EphA2GAPDH
图5 WRNA 干扰法抑制EphA2表达后Westem blot 法检测肝癌细胞
Hep3B 和MHCC97H 细胞中EphAO 蛋白的表达情况
Fig. 3 Western blot detected the proteis expressho oI EphA2 is Hep3B
and MHCC97H iter suppressing Be expressho oI EphAO
2.2 siRNA -EphA2能显著抑制肝癌细胞中Grb2的表达
WRNA 干扰法抑制EphAO 表达后，肝癌细胞株Hep3B 和
MHCC97H 中GrdO 的表达呈明显下降 ，差异具有 学
意义（P<0.05）,见图9o
3讨论
促红细胞生成素肝细胞受体（Eph 受体）最早发现于肝 细胞肝癌细胞中［6］,是 为止发现的 的酪氨 酶家
中的一种⑺，起初发现其功能可能与细胞的运动有关［］,
随着研究的深入发现Eph 受体与多种肿瘤的发生、发展、侵
袭和转移都有密切关系一2 ］。

EphAO 是Epi
成员中被发现的具有酪氨酸酶活
性的第一个基
码产物，它是590年LILDBERG 等［5从
上皮细胞cDNA 文库中 的，近些年发现其在消化系 中均有表达2
的侵袭性相关［5 ］ 3
MIYAZAKL 2 ］发现EphAO 蛋白在食管癌中过表达
分化程度差、患者预后不良及 转移有关,HOU 等［4 ］发
现EphAO 蛋白在胃癌中可通过调控上
转化蛋白（E-
钙黏连蛋白、B-连环蛋白、波形蛋白）进 调 的
深度、TNM 分期及 转移。

CUI 等［5 ］发现EphAO
在 癌中可能通过激活mTORC1和RaiLyyO 通路参
的生长和转移。

KOU 等［6 ］发现EphAO 在结直肠癌中也 有表达。

随着对EphAO 研究的深入,YANG 等"］发现EphAO
在肝癌组织中高表达，且与肝癌的侵袭性有关。

WU 等［5 ］
发现EphAO 可能与肝癌中 生成有关，然而其内在的可能
清楚。

为了探讨EphAO 参与调控肝癌细胞侵袭性
的可能
，我们选取培养肝癌细胞株MHCC97H 、Hep3B 和
肝细胞HL -7702,分别检测三类细胞的侵袭性和EphAO 的表达，就侵袭力而言，MHCC97H >Hep3B >HL -7702,随 着侵袭能力的增强,EphAO 的表达量增高，提示EphAO 可能
肝癌细胞的侵袭相关。

150-1
Hep3B
500 n
MHCC97H
o
o
o 5V
o o n
M o
o n r v x s-332H
£.
0 J ~L -n J ----------L -r J -----------—Untreated Control Intervention group group group 0 1 1 i 1—
Untreated group
Control group Intervention group
图6 WRNA 干扰法抑制Grd2表达后Traoswell 小室检测肝癌细胞Hep3B 和MHCC97H 的穿透细胞数(与对照组相比，* P <9. 95) Fig. 2 Traoswell chambes detech the idvvsiox ability oI Hep3B and MHCC97H ages suppressing the expressho oI Grd2 ( compared with cootrol group ,
*P
<2.25)
MHCC97H Untreated group Control group Intervention group
Hep3B
图7WHNA干扰法抑制GrP2表达后Transwell小室检测肝癌细胞Hep3B和MHCC97H的侵袭情况(结晶紫染色x496)
Fiy.4Transwell chamber detech the invasion agility of Hep3B and MHCC97H after suppressina We expression of GrP2(cmstai violet staining x406)
Hep3B
Untreated Control Intervention
group group group
MHCC97H_____________
Untreated Control Intervention
group group group
Grb2
GAPDH
图8WRNA干扰法抑制GrP2表达后Westect blot法检测肝癌细胞Hep3B和MHCC97H细胞中GrP2蛋白的表达情况
Fiy.J Westect blot deWcWp the protein expression of GrP2in Hep3B and MHCC97H after suppressing the expression of GrP2
Hep3B
Untreated Control Intervention
group group group
MHCC97H
Control Intervention
group group group
Untreated
图9WRNA干扰法抑制EpPA2表达后Westect blot法检测肝癌细胞Hep3B和MHCC97H细胞中GrP2蛋白的表达情况
Fiy.9Westect blot deWcWp the protein expression of GrP2in Hep3B and MHCC97H after suppressing the expression of EphA0
为了进一步探讨其可能机制，我们运用siRNA转染法抑制肝癌细胞中EphA2表达后,EphA2表达明显下降，检测侵袭力发现随着EphA2的表达受后见千癌细胞的侵袭力明显下降，提示EphA2可能了肝癌细胞的侵袭过程。

对于EphA2如何调控肝癌细胞侵袭的内在清楚。

GrP2是一种衔接蛋白，普遍表达于各种细胞信号通路中，有研究发现其在受体酪氨酶通路中起关键作用，与的发生、发展具有相关性[17]。

YE等[、发现GrP2在胃癌中高表达且可影响癌细胞的迁移和侵袭。

ZHU等[21]发现
GrP2在食管癌中调控癌细胞的转移和侵袭。

WANG 等[2]发现GrP2在胰腺癌中高表达。

DING等皿]发现GrP2
在结直肠癌中的高表达是患者预后不良的 影响因素，其
表达减少可直肠癌细胞增殖能力。

GrP2与肝癌的关
系少有研究者报道，我们检测了GrP2蛋白在肝癌细胞中的
表达情况，发现GrP2蛋白在肝癌细胞中有表达着肝癌
细胞侵袭力的增强其表达也随之增高。

为了进一步验证GrP2蛋白可能与肝癌细胞的侵袭性相
关，我们通过siRNA转染法肝癌细胞中GrP2的表达后,
GrP2的表达明显下降,检测侵袭力发现随着GrP2的表达受后见千癌细胞的侵袭力明显下降，提示GrP2可能了肝癌细胞的侵袭过程。

进一步检测显示在EphA表达后,Grb2蛋白的表达下降见音示EphA2可能通过调控GrP2的表达见肝癌细胞的侵袭过程，但是具体调，制需进一步研究。

综上所述,EphA2在肝癌细胞中调控肝癌侵袭可能是通过调控Grb2的表达来实现的，提示EphA2可作为肝细胞肝癌临床治疗的新靶点，但其内在有待于进一步研究。

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(编校：张西敏)
本期审稿专家名单
（按姓氏笔画排名）
王建王哲王茂德王建生刑金良B正刘秋芳刘振堂孙学军李恩孝杨光吴涛吴开杰张王刚张秀敏张明鑫张冠军张淑群陈丽宏姚煜秦思达倪士峰凌瑞高成阁梁秀芬程继文楚雍烈雷光焰廖子君。