考力代绵羊选育与种质资源开发利用技术报告

《考力代绵羊选育与种质资源开发利用》项目
技术报告
一、研究的目的意义
考力代绵羊是贵州半细毛羊培育的主要父本，已适应在山区高寒、高湿条件下生长，成为毕节市本土化绵羊品种，深受老百姓喜爱。

由于农户饲养方式较传统，品种选育意识不高，以致该品种出现退化现象，生产性能在下降，存在养殖比较效益不高的问题，所以，开展考力代绵羊的提纯复壮，对推进毕节市养羊业的发展具有重要意义。

二、主要研究内容
1、开展提纯复壮研究。

采取传统选育及分子标记辅助选育相结合的方法，使考力代羊生产速度、繁殖性能有所提高。

2、开展营养调控研究。

组建试验羊群，设计营养配方，进行饲料配方筛选。

3、开展杂交试验研究。

导入生长速度快、繁殖性能高的外血品种杂交，观察后代生产性能，为新品系培育奠定基础，为考力代羊开发探索新路子。

三、项目研究内容完成情况
（一）考力代绵羊提纯复壮研究
1、核心群的组建
项目经过初步选择标准选择后，建立了核心群。

核心群成员除了以上的种羊外，以后不断地从其后代羊群中挑选成绩优秀的个体，对核心群进行补充和扩大，不断提高核心群的总体水平，核心群组建后，由于
有后代的参与，要做好每只羊的档案记录和配种安排，避免近交衰退。

通过选种选配和后裔选择，在贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司种羊场建立了核心群（表1）。

表1 考力代绵羊种羊选择标准 单位：kg 、cm
2、生产性能 （1）体重水平
项目实施后，核心群周岁公、母羊体重55.76kg 、45.69kg ，比选育前提高15.66%、15.76%；核心群成年公、母羊体重65.86kg 、
49.72kg ，比选育前提高24.24%、17.26%。

（表2）。

表2 实施前后核心群体重统计 单位：kg 、只
（2）产毛量、羊毛长度及细度
根据测定，成年公、母羊产毛量分别为5.88kg 、4.86kg ，提高5.76%、17.96%，羊毛长度分别为12.78±5.23cm 、11.23±4.95cm ，羊毛细度分别为28.44±5.1um 、27.86±5.72um （表3）。

表3 产毛量、羊毛长度及细度测定统计 单位：kg 、cm 、um
（3）屠宰率测定
屠宰周岁羯羊3只，周岁羊屠宰率为51.01%，净肉率34.54%（表4）。

表4 考力代绵羊屠宰测定
（4）产羔率
项目点产羔统计，平均产羔率为112.32％，繁殖成活率达91.6%。

可见考力代绵羊产羔率低，还需加强双羔母羊的选择（表5）。

表5 考力代绵羊繁殖性能统计
（二）生长速度、繁殖性能和毛用性状相关基因分子标记研究
对影响毛羊的生长性状的基因GHSR、CIS、繁殖力性状的基因GDF9、BMP15、ESR、毛用性性状的KRT26为侯选基因进行筛选，采用PCR产物直接测序法对上述基因进行单核苷酸多态性检测，以期寻找到与高繁殖力，高生长，毛用性能好相关的SNP S，确定基因效应，探求与三个性状相关的遗传标记，为考力代绵羊的进一步选育提供理论依据。

（1）实验样品：考力代绵羊选自马干山种羊场，自繁自养，健康状况良好的基础经产母羊共36只。

（2）实验方法
采集样品：每只羊通过颈静脉采集血液，装在真空抗凝采血管中，快速振荡混匀，放入冰盒，带回实验室-20℃冰箱保存备用。

羊基因组DNA的提取：采用EZUP柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，并用紫外分光光度计测量其浓度测OD值，计算 OD 260 / OD 280 比值，若比值接近 1.8 ，说明样品中的蛋白质去除的比较干净；若比值小于 1.6 ，说明样品含有较多的蛋白质或其它离子， DNA抽提效果不好，需重新提取。

引物：根据 GenBank 发表的绵羊GDF9基因(登录号：NC_019462)的第二外显子、BMP15基因(登录号: NC_019484.1)的第二外显子、ESR 基因(登录号:NC_019465.1)部分外显子序列，GHSR(登录号: NM_001009760.1)，CISH (登录号:NC_019476.1)、KRT26(登录号: XM_004012872.1)第一、二外显子，采用Primer5.0软件自行设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表6 。

表6 引物序列、产物长度及退火温度
使用真空冷冻干燥的OligoDNA为白色粉末，附在离心管内壁上。

稀释前，将引物管离心数秒使 DNA 聚集到管底，加入100倍摩尔数的双蒸水，盖好管盖，涡旋震荡混匀并使其充分溶解，然后再离心数秒，保存
4℃冰箱过夜。

第二天取出放入-20℃保存备用。

PCR产物检测：取PCR扩增产物4µl,同时用DL2000DNAMarker作参照，点样于1%琼脂糖凝胶中电泳，电压120V，电泳25min。

电泳结束后将琼脂糖凝胶放在凝胶成象系统上观察并记录扩增片段的大小和浓度，选取扩增效果好且量足的样品进行后续实验。

测序和BLAST分析：将特异性好、产量高的PCR产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行纯化和双向测序，测序结果利用 DNASTAR 软件对测序结果进行校正，BLAST分析确定SNPs。

（3）结论
根据绵羊GDF9基因序列的第二外显子、BMP15基因序列的第二外显子、ESR基因部分外显子、GHSR基因的第二外显子、CISH基因的部分外显子、KRT26基因的第二外显子序列设计引物，采用PCR产物直接测序法检验在品种中的基因多态性，并与产仔数，生长性能，毛用性能进行相关分析，结论如下：
一是对六个基因进行PCR扩增，确立了最佳PCR反应条件和反应体系，对PCR产物纯化后进行直接测序，测序结果显示考力代绵羊品种的三个性转的六个基因中，影响繁殖性状及生长性状的五个基因均为中度多态，而影响毛用性能的KRT26基因比较稳定。

二是检测GDF9基因在第2外显子的562 bp处有 1个A→C的单碱基突变,碱基突变导致谷氨酰胺突变为脯氨酸。

考力代绵羊产羔数在两个基因型之间呈现出AC>AA，差异极显著( P<0.01 ) 。

三是检测BMP15基因外显子2的480bp处发现C→G 碱基突变，碱基突变导致谷氨酰胺突变谷氨酸。

考力代绵羊BMP15基因产羔数在两个基因型之间呈现出CG>CC，差异显著(P<0.05 ) 。

四是在ESR基因中检测出2个单碱基突变，在第841位点发生了由
G→A碱基突变;第1018位点发生了由G→T碱基突变，碱基突变没有引起氨基酸的改变。

ESR基因产羔数在三个基因型之间呈现出GA>GG，差异显著( P<0.0 5) ；产羔数在三个基因型之间呈现出TT>TG>GG，差异极显著(P<0.01 ) 。

五是在GHSR基因中检测出2个单碱基突变。

T70G和G229T均引起氨基酸同义突变。

突变前后GHSR基因RNA二级结构发生改变，最小自由能由-378.3 KCal/mol变为-377.6 KCal/mol，并影响到蛋白质二级结构的稳定性。

六是在CISH基因中检测出第二外显子的213bp处有一个T→C的单碱基突变，为同义突变，没有引起氨基酸的改变。

七是影响毛用性能的基因KRT26没有突变发生，结构比较稳定，不会引起考力代绵羊毛用性能发生改变。

（三）考力代绵羊导入外血提高生产性能的杂交组合试验
项目实施中开展两个杂交试验，分别利用陶赛特绵羊和萨福克绵羊与考力代绵羊杂交，陶考杂F1代、萨考杂F1代3.5月龄断奶体重分别为16.34±2.94kg、18.75±4.53kg，比考力代15.19±4.28kg分别提高了7.57%、23.44%，杂交试验效果显著（表7）。

表7 杂交试验统计
（四）设计配方，筛选饲料配方
根据贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司饲料原料情况筛选出的相关饲料配方见表8-16。

表8 考力代绵羊种公羊非配种期全混日粮配方及营养成分
表9 考力代绵羊空怀和妊娠前期母羊混合精料配方
表13 考力代绵羊哺乳期羔羊补料配方及营养成分
表16 考力代绵羊育肥后期精料配方
四、项目取得成效及创新
（一）品种整齐度趋于一致
提纯复壮前，羊场同年龄羊只个体大小不一，生产性能参差不齐。

提纯复壮后，公羊雄壮，母羊清秀，品种整齐度大大提高。

（二）生产性能显著提高
与项目实施前相比，项目实施后，核心群周岁公、母羊体重55.76kg、45.69kg，比选育前提高15.66%、15.76%；核心群成年公、母羊体重65.86kg、49.72kg，比选育前提高24.24%、17.26%；成年公、母羊产毛量分别为 5.88kg、4.86kg，提高 5.76%、17.96%，羊毛长度分别为12.78±5.23cm、11.23±4.95cm，羊毛细度分别为28.44±5.1um、27.86±5.72um；周岁羊屠宰率为51.01%，净肉率34.54%；平均产羔率为112.32％，繁殖成活率达91.6%。

（三）建成的品种群繁殖率异常旺盛
项目实施，建考力代保种群452只，其中品种整齐度好的核心群118只、生产群334只。

据统计：公羊占12.56%，母羊占87.44%，公母羊比例基本达到1：7，周岁以上5岁以下种羊占69.85%，说明羊群处于一种动态的、后备力异常旺盛的状态。

（四）筛选饲料配方取得实效
针对考力代绵羊生长发育的各个时期，设计饲料配方主要解决饲料结构单一，营养不全，维生素、微量元素缺乏，增重速度慢等问题。

通过实地考察和长期的饲喂对比试验筛选出的组方适口性好、营养较全面、增重速度较快。

通过饲喂筛选出的相关饲料配方，把好营养调控关，
可有效提高羔羊成活率，降低发病率，提高生产性能。

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