植物低温胁迫适应性应答综述

植物低温胁迫适应性应答综述
摘要：对植物低温胁迫适应性应答的研究进展，包括低温诱导蛋白、低温转录因子、低温信号转导、不饱和脂肪酸酶，以及低温次级氧胁迫进行了综述。

关键词：植物；低温胁迫；适应应答
低温胁迫包括0-12℃之间的冷胁迫(chillingstress)和0℃以下的冰冻胁迫(freezing stress)两种。

它是一种严重的自然灾害，不仅限制作物的区域分布和生存，还对作物产量有很大影响。

探讨植物在低温胁迫下的生理生化变化及其抗寒冻机理。

对改善作物抗寒冻性能，提高经济作物产量，改善环境绿化状况均有十分重要的理论与经济意义和社会效益，是人们关注和研究解决的植物生理学和农业问题之一。

1 低温胁迫下的植物损伤
环境温度改变会引起物质在水溶液中发生物理化学变化。

随着温度降低，水分子的粘滞性可以增大几倍。

使得溶剂以及水分子的扩散速率下降，盐的溶解性也降低，而气体的溶解性增大。

生物体缓冲系统的pH提高。

另外，细胞结冰往往伴随着脱水。

使细胞内渗透压增大，细胞体积缩小。

质膜系统和细胞骨架受到损伤，气体交换受阻，生物大分子结构改变并导致功能丧失，有害物质积累，植物细胞器如线粒体、叶绿体、核糖体的结构与功能也受到影响。

植物体内包括光合、呼吸、生长发育、代谢、蒸腾以及营养水分吸收等在内的几乎所有的生命活动都会不同程度地受到寒冷胁迫的干扰。

有关植物冷害的最早学说是Lyons在1973年提出的“膜脂相变”学说。

该学说认为，与热激胁迫所引起的蛋白质变性以及折叠受阻不同，低温对冷敏感植物的伤害首先是改变了磷脂双层膜的膜相，尤其是改变了质膜的空间构象和物理状态，使从片层(lamellar)转变为非片层(non-lamellar)或六方晶Ⅱ(hexagonalⅡ)，从液晶相转变为凝胶相。

膜相的改变可能抑制细胞膜发挥正常功能，而构象的改变影响了膜的稳定性，使蛋白质从膜上解聚下来，发生膜融合。

2低温胁迫对植物细胞生物学和生物化学的响应
虽然植物不能像动物那样靠运动来趋利避害，但在长期进化过程中也形成了多种在寒冻环境下生存的适应机制，包括被动适应机制和主动适应机制。

前者指植物体自身具有的结构障碍，如叶片较小、栅栏组织发达、细胞壁衍化成角质层、
蜡质、木质、栓质、表皮毛和特殊气孔等附属结构，这些附属结构以及木质部间的导管组织能阻止水分子和冰的扩散运动。

后者与植物的诱导性抗寒冻防卫反应有关，包括改变酶系统以及植物激素调控系统的表达：修饰膜组成，增加能降低相变温度的不饱和脂肪酸含量；增加能抑制冰晶生长速率、提高熔点的细胞壁上的阿拉伯木聚糖：增加与细胞识别有关的细胞表面糖蛋白：提高微管的低温稳定性：提高细胞内一些抗冻分子物质如简单的糖类(蔗糖、葡萄糖、海藻糖等)、多元醇、内铵盐/甜菜碱(对ycinebetaine)、脯氨酸、多铵、自由氨基酸、可溶性蛋白质或亲水性多肽和脱落酸等的含量，这些抗冻分子含有(多)羟基，能结合水分，因而能降低细胞水分的减少，稳定大分子和膜的结构。

传统提高植物耐受冻害的方法主要有：①根据形态(如株高、产量)或生理生化指标，采用传统遗传育种手段，培育抗寒冻品种；②改变作物的栽培方式，适地适种，深翻地，涂白。

树盘培土，覆盖杂草薄膜。

熏烟驱寒等；③使用抑制植物生长的激素如脱落酸(ABA)、矮壮素(CCC)、比久(B-9)，以及化学保温剂如煤油乳剂和农业泡沫精(agrifoam)等来调节植物代谢活动，影响植物生长状态。

改善植物抗冻害能力。

这些传统方法对提高植物抗寒冻能力有一定实用效果，但存在作用周期长，并且植物叶面有较厚蜡质，药物难以进入叶内细胞，不能有效改变植物抗寒冻性等问题。

用现代分子生物学技术，从分子水平上进一步阐明植物抗寒冻机制，将有助于对植物抗寒冻作用本质的了解，为有效改良植物抗寒冻能力建立基础。

3植物的抗寒冻机制
虽然低温是限制生物生存和分布的主要因素之一，即使在像南极和北极那样极端寒冷的环境下，也有生物生存。

多数植物经低温驯化(cold ac—elimation)后，其抗寒冻能力都增强。

经过大量研究，目前人们对植物冷驯化机制有了一定的了解。

植物在人工低温冷驯化下，通过上游调控来维持呼吸作用、光合作用和蛋白质合成代谢的进行而获得对寒冻的抗性。

在人工低温冷驯化过程中，一系列低温诱导基因被诱导表达，植物系统获得性抗寒冻性是与低温诱导基因的诱导表达密切相关的。

目前研究低温诱导基因及其表达调控的方法主要有3种：①运用现代分子生物学技术包括高通量cDNA微阵列或基因芯片技术、酵母单(或双)杂交方法、DNA标签法和差别展示技术等直接分离与冷驯化相关的基因；②运用传统/正向遗传学和反向遗传学方法包括图位克隆法、转座子或T-DNA插入的定向基因失活技术、反义RNA和共抑制技术以及基因沉默技术，筛选并研究大量突变群体中的低温胁迫基因作用位点和功能；③运用分子探针分析酶切扩增多态序列(CAPS)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和数量性状座位(quantitative trait loci，QTL)谱，确定低温诱导基因遗传图。

运用现代分子生物学技术，大量与植物低温诱导表达相关的基因已得到分离和鉴定，
但一些组成性基因表达与植物耐冷机制之间的关系还未全面揭示。

基于胁迫损伤或耐性表型的遗传筛选方法，与现代分子生物学技术相辅相成，在植物低温转录因子表达、胁迫信号传递和代谢途径的研究中发挥着越来越重要的作用。

3.1 丰富多样的植物低温诱导蛋白质
分析低温诱导基因编码的蛋白质的氨基酸组成、序列、结构特征以及进行同源性比较，发现低温诱导蛋白质中有直接与提高植物抗寒冻性、保护细胞免受冻害的功能性蛋白质如胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)、抗冻蛋白、DNA结合蛋白、mRNA结合蛋白、分子伴侣、离子通道蛋白、bZip蛋白以及能保护其他酶类的蛋白质等：有改变膜脂组成的合成酶如脂肪酸不饱和酶：有降解毒性物的抗氧化胁迫酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等；也有调控寒冷信号传导、抗寒冻基因表达和抗寒冻蛋白质活性的调控性蛋白质包括低温转录因子、蛋白激酶以及一些蛋白酶。

晚期胚胎发育蛋白(LEA蛋白)主要出现在种子胚发育的晚期，具有富含Lys 的K节和富含Gly的φ节。

研究低温诱导蛋白质的结果表明，许多低温诱导蛋白质与LEA蛋白在氨基酸序列上有高度同源性，结构上普遍具有以下几个特点：含有大量亲水性氨基酸，在沸点下保持稳定：氨基酸组成简单，仅由几个氨基酸构成，Gly、Ala含量较高；具有重复序列结构。

内部缺少折叠区，受热难于聚集；形成双亲α-螺旋，其疏水区与部分变性蛋白质及膜相互作用，阻止蛋白质和膜进一步变性，而亲水区与其它蛋白质结合，可能具有蛋白质分子伴侣作用。

在低温下稳定膜结构与功能。

3.2低温转录因子DREB1/CBF可以同时调控多个植物低温诱导基因表达，增强植物耐冻性
高等模式植物拟南芥低温诱导基因COT(cold—regulated)基因，也称kin(cold-induced)、rd(respon-sive to dehydration)、lti(low-temperature induced)或erd(early responsive to dehydration)基因，所编码的多肽根据氨基酸组成可分成四类：COR6.6/KIN2、CORl5a、RD29A/LTl78/COR78和COR47/RD17，其中COR6.6蛋白与富含丙氨酸的鱼类抗冻蛋白I在氨基酸组成上极为相似，RD29A和RDl7蛋白类似于LEAⅡ蛋白，CORl5a蛋白可能与质膜相互作用，阻止六方晶Ⅱ相发生，提高质膜冷稳定性，增强叶绿体和原生质体的抗冻能力。

研究基因缺失和碱基突变的结果表明，cor15a基因启动子的顺式作用元件包括上游的C-repeat元件。

也称CRT，或DRE(dehvdration-responsive el-ement)，或LTRE(low temperature responsive ele—ment)，其核苷酸序列是TGGCCGAC，以及下游的ABA响应元件ABRE，具有保守的6核苷酸序列TACGTG。

此外，在rd29A基因启动子的顺式作用元件中也发现ABRE以及类似于CRT的脱水响
应元件DRE，其核苷酸序列是TACCGACAT。

CRT/DRE/LTRE元件或其核心序列CCGAC，广泛存在低温、高盐及脱水应答中一些诱导基因的启动子中，但它对ABA的快速诱导没有响应。

采用拟南芥corl5a或rd29A基因的CRT/DRE元件。

以及酵母单杂交方法。

经凝胶移位和基因芯片技术，结合位点选择分析以及反式激活分析。

已经分离和克隆了与低温胁迫耐性相关的转录因子CBFl，2，3/DREBlB，1C，1A。

CBFs 具有AP21ERF DNA结合域。

可以识别和结合CRT/DRE元件。

正常生长条件下，野生型拟南芥植物中的CBFs、cor6.6、cor15a、cor47和rd29A基因不表达。

植物经低温冷驯化15min后。

体内的CBFs基因开始表达，约2h左右。

上述cor 基因表达。

CBFl或CBF3组成性过量表达，促进下游的cot基因也组成性地高水平表达，与cor15a单独表达相比，它可以使整株转基因植物耐冻性提高3.3℃。

用含基因的启动子控制DREBIA在转基因拟南芥植物中表达，植物的抗冻、抗干旱和耐盐性提高。

遗传分析发现，ICEl(inducer of CBF expressionl)作为CBF3的激活子，能识别和结合CBF3启动子的MYC/B序列。

转ICEl基因植株的CBF3，RD29和cor15a在低温下高表达。

最近发现的转录因子CBF4显示了植物对低温和干旱胁迫反应进化上的相近性。

CBF4受干旱胁迫诱导。

但不受低温胁迫诱导。

在转基因植株中，过量表达的CBF4不但植物抗干旱能力增强，而且植物的抗冻性提高。

CBF4的原始基因很可能具有调控植物对干旱胁迫作出响应的功能，经过基因复制、启动子趋异及选择、外显子重组等作用，逐渐具有调控植物耐低温的特性。

由于CBF/DREB1能诱导多种与胁迫相关的基因表达，而极大地增强植物抗逆性，因此具有广泛的应用价值，目前已成为人们研究的热点之一，国内外许多研究机构已经利用导入该转录因子来提高植物的抗寒性、抗旱性，并且获得了一定的成功。

3.3遗传突变研究正逐步揭示CBF/DREBl与辅助因子相互作用调控下游基因表达的机制
在一些基因表达过程中，转录因子并不直接与顺式作用元件结合，经过辅助因子活化后才能调控下游基因表达。

在拟南芥植物中发现类似酵母的适配器(adaptor)ADA2和具有组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性的GCN5蛋白。

目前推测，CBFs激活冷诱导基因表达依赖GCN5和ADA2的相互作用。

CBFs的酸性C端可能引导复合物到基因启动子，使HAT修饰组蛋白，改变染色质结构，使之更容易与mRNA聚合酶结合。

T-DNA插入ADA2和GCN5中，导致拟南芥突变体植物的cot基因转录本降低，但对CBFs表达没有影响。

用遗传突变方法筛选到一些能影响cot基因表达，但对CBF/DREBl转录因子没有影响的遗传突变位点可能会成为研究低温胁迫信号传导和胁迫基因功能的有力工具。

拟南芥冷敏感突变体sfr6就是其中的一个。

Knight等利用基因敲除及分子标记技术。

筛选到一些拟南芥冷冻敏感突变体sfr(sensitive to freezing)，它们分别对冷冻处理显示出不同的生长发育和细胞生理损伤行为。

分子生物学研究发现，sfr6突变体植物中检测不到cor基因表达，但与cor基因启动子CRT/DRE元件结合的CBF/DREBl基因表达正常。

因此他们认为。

SFR6蛋白可能对CBF/DREBl激活下游基因表达起
正调控作用。

植物是一个复杂而精致的有机体，体内代谢物的合成与分解总是处于微妙的动态平衡状态以感应外部环境变化，维护机体进行正常代谢。

Ishitani等在拟南芥植物中发现的HOSl蛋白(high ex-pression of osmotically responsive genes)可能参与降解与CBF/DREBl表达相关的一种正调节器(positive regulators)，对冷信号传递进行负调控。

拟南芥hosI突变体植物能在低温下提前开花，其CBF/DREBl 表达水平高于野生型植物，并且cor基因也过量表达。

研究还发现，HOS1具有泛素功能，可以降解ICEl。

随后发现的转录因子HOS9能对cor基因表达进行负调控，但不依赖CBF途径。

通过遗传突变发现的另一个对低温胁迫有负调控作用的基因是eskimol(eskl)。

eskl突变体植株含有比野生型植株高的脯氨酸、总糖、以及高表达的RABl8(LEAⅡ)，从而能耐受寒冻，但对COR基因的表达没有影响。

拟南芥植物转录组一表达谱的研究结果也证明了冷驯化过程中存在低温诱导基因表达的抑制途径。

3.4 Ca2+、ABA及蛋白质磷酸化上游调控低温诱导基因表达细胞膜上的钙离子通道和双组分蛋白激酶等信号感受器接受低温胁迫信号后，诱导(保卫)细胞释放Ca2+，或者诱导细胞产生二级信号分子如肌醇多聚磷酸盐、环ADP核糖以及烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸盐等，刺激细胞释放ca2+，激活蛋白激酶参加蛋白质磷酸化代谢过程。

诱导胁迫靶基因表达。

用Ca2+螯合剂、Ca2+通道阻断剂和转钙离子通道蛋白基因技术的研究结果表明，作为第2信使的Ca2+参与植物对低温响应过程，并与一些植物低温诱导基因的表达调控相关。

如拟南芥的cor6.6/kinl和苜蓿的cas15。

通过改变二级信号分子的生化代谢途径，影响钙离子流释放水平，可以调节低温胁迫基因表达，影响植物的耐冻性。

拟南芥FRYl基因编码肌醇多聚磷酸盐1-磷酸酶，能降解信号分子肌醇1，4，5一三磷酸盐(IP3)，对冷信号传递进行负调控。

frvl突变体植物的IP3含量比野生型高，cor基因表达增强，其抗冻性也提高㈣。

与Ca2+耦合的Ca2+依赖蛋白激酶(CDPKs)，其结构上具有显著的Ca2+感受器特点：C端具有EF-hand基序，能与ca2+结合，N端可以与细胞膜结合。

低温诱导细胞内的Ca2+量增加，激活CDPK，增强水稻耐低温和耐干旱能力。

用基因沉默技术可抑制分解CDPK的蛋白质磷酸酶2C基因表达和促进冷诱导基因表达。

提高转基因植物的冷驯化水平。

ABA参与植物中许多生理代谢活动，如调控一些与种子成熟、脱水和外界胁迫相关基因的表达等。

早在20世纪80年代初，人们就注意到植物抗寒性与ABA有关。

虽然低温驯化(4℃/2℃)或用外源ABA处理能诱导低温诱导基因表达和增强植物抗寒能力，并且ABA缺失突变体aba-1植物或不敏感突变体abi-1植物的ABA合成受阻或对ABA的不敏感，会导致植物耐冻性下降。

但是aba-1突变体植物的cor基因表达正常。

并且abi-1能影响ABA诱导的COF基因表达，对低温诱导的COF基因表达没有影响，而ABRE缺失也不影响低温胁迫因子对CRT/DRE的诱导表达。

以前研究的结果认为ABA可以诱导植物低温诱导基因表
达，与这里的植物低温诱导基因的表达并不依赖ABA的结果似乎是相悖的。

但现在的一些遗传学研究证明，植物低温诱导基因的表达不存在不依赖ABA的调控途径。

用萤火虫荧光素酶基因(RD29A-LUC)转基因植物为材料，分离到两个拟南芥突变体los5和los6。

这两个突变体植物不能合成ABA，rd29A、corl5a和cor47等的表达也比野生型低。

遗传学分析表明，10s5是aba3的等位基因，los6是abal的等位基因。

3.5不饱和脂肪酸酶基因的表达
作为细胞与外界接触的第一道屏障的细胞膜在感受传导外界信号，维持生物体正常生理代谢中有很重要的作用。

Rou出art研究74种植物膜脂的PG脂肪酸组成与抗寒性之间的关系时，发现细胞膜脂肪酸的不饱和度对植物抗寒性有很大影响，细胞膜脂的不饱和脂肪酸含量越高，植物的抗寒性越强。

用脂质体原生质体融合和基因转化技术转化甘油3-磷酸酰基转移酶基因和转ω-3脂肪酸去饱和酶基因FAD2-8，以影响转基因植株脂肪酸的不饱和度后，可以降低或增强转基因植株抗寒性。

但拟南芥的另一个突变体fabl的PG饱和脂肪酸表达水平却提高。

植株的抗低温性也增强，这显示PG饱和度并不是唯一影响植株抗寒性的因素，可能还有其他因子参与低温调控。

不饱和脂肪酸含量增加，能降低熔点，改变相变温度，增加膜脂的流动性，从而有利于细胞膜的稳定。

转脂肪酸不饱和酶基因的研究进一步验证了低温冷害的“膜脂相变”学说。

也是目前采用基因工程改良植物抗寒冷性的途径之一。

3.6低温下的植物次级氧胁迫
活性氧(O-2、H2O2、OH、1O2)是细胞正常代谢产物。

正常情况下，细胞内活性氧的生成和分解保持平衡。

若这种代谢平衡遭到破坏，如低温胁迫下，活性氧生成速度快于降解速度，由于没有降解的活性氧在细胞内积累，将攻击膜，使蛋白质变性降解，导致DNA突变，于是发生次级氧胁迫。

维持活性氧平衡并防止活性氧氧化作用的发生是一些还原剂如脂溶性的维生素E(VE)和水溶性的维生素C(VC)、谷胱甘肽(GSH)以及一些抗氧化酶类：CAT、POD、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)。

低温氧化胁迫的研究结果表明，冷驯化能诱导GSH含量增加和抗氧化酶类SOD、APX、GR、POD活性提高，从而增强植物抗低温胁迫能力：采用转基因技术提高植物活性氧清除剂含量也能降低植物寒冷损伤。

提高植株抗寒性。

关于氧胁迫与ABA、Ca2+以及其他信号分子在低温胁迫中的关系还有待进一步研究。

4结语
植物在感受到寒冷信号如气温降低、短日照等之后，将产生抗寒促进因子(如ABA)，与钙信号系统共同完成抗寒信号的转导，启动抗寒基因的表达。

植物在感受和转导寒冷信号的过程中。

有多种调控基因参与编码产生信号传递因子和调控蛋白质，这包括各种转录因子和蛋白质激酶。

目前对植物感受和转导寒冷信号的机制，以及植物抗寒冻的确切分子机制尚不很清楚。

ABA与Ca2+信号转导途径是如何协同作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子，转录因子又是如何调控各种抗寒基因的表达，各种抗寒基因又是如何发挥抗寒活性等问题的分子机制研究是植物抗寒冻基因工程的基础。

植物低温诱导蛋白质的研究虽然已取得很大进展，但迄今对低温诱导蛋白质的研究主要还是通过分析其与已知蛋白质的同源性及一些生理现象确定的，除少数确定为植物适应胁迫过程中的必需蛋白质外，大部分低温诱导蛋白质的功能及其表达机制仍不清楚。

随着全序列测定物种的增加以及大量表达序列标签(EST)的产生，精细遗传和物理图谱的构建。

反向遗传学、蛋白质组学和比较基因组学在基因功能研究中越来越显示其重要性，人们对复杂信号的表达、传递和代谢系统的了解必将越来越清晰。