双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取技术的研究现状与应用
基本内容
3、环保领域：双水相萃取技术在废水处理、重金属离子去除等方面具有潜在 应用价值。例如，通过双水相萃取技术成功实现了对含有重金属离子的废水的处 理，降低了废水中的重金属离子浓度。
基本内容
双水相萃取技术的研究方法双水相萃取技术的研究方法主要包括以下内容： 1、影响因素研究：双水相萃取技术的分离效果受到多种因素的影响，如双水 相体系的组成、目标物在双水相体系中的分配系数、实验温度和pH值等。通过对 这些影响因素的研究，可以优化双水相萃取工艺，提高目标物的分离效果。
基本内容
3、双水相萃取技术的设备研发和工艺优化将成为未来的研究重点，以进一步 降低操作成本，提高实际应用中的效率和稳定性。
基本内容
4、双水相萃取技术与其他新兴技术的结合，如微流控技术、纳滤技术等，将 成为未来的一个重要研究方向，以实现更高效、更便捷的分离和纯化过程。
基本内容
结论双水相萃取技术作为一种有效的分离和纯化技术，在食品、制药、环保 等领域已得到广泛应用。通过对该技术的研究和应用，不仅有利于促进相关领域 的技术进步，提高生产效率和产品质量，还有助于推动相关产业的绿色发展，为 实现可持续发展作出贡献。未来，随着科学技术的不断进步和创新，双水相萃取 技术将在更多领域展现其巨大潜力，为人类社会的进步和发展作出更大贡献。
基本内容
展望未来双水相萃取技术在多个领域显示出广泛的应用前景，但仍存在一定 的挑战和问题需要进一步探讨和研究。未来的发展趋势可能包括：
基本内容
1、双水相萃取技术的理论研究将更加深入，以进一步优化双水相体系的组成 和性质，提高目标物的分离效果。
基本内容
2、双水相萃取技术的应用领域将进一步拓展，特别是在新能源、新材料、生 物医药等领域的应用研究将更加活跃。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究随着科学的发展，分离技术也在不断地创新。
水相和有机相两种类型已经被广泛地应用到生物领域中去了。
双水相萃取技术的概念最早来源于1989年，该技术对多组分的复杂混合体系进行了高效率的分离。
在一个混合液相体系中，加入一种电解质溶液使之形成不互溶的两相，一相为水相，另一相为有机相。
两相的pH值、离子强度、温度等都会影响最终产物的浓度。
因此，在研究这一类型的分离技术时，必须要考虑到整个体系的动态变化情况。
双水相萃取技术的优点是很明显的：一次性可同时从两个相中分离出不同的组分，节省试剂，降低成本，提高分离效率；避免了两相体系的选择性，在低相对分子量或者微相对分子量的情况下也能得到良好的分离效果。
但是它仍存在以下缺陷：两相的液膜阻碍了反向渗透作用，产生絮凝和乳化现象；高压使两相间的平衡电位差增大，提高了两相间的分配系数。
目前双水相萃取技术还不够完善，尤其是对一些低分子量的蛋白质（尤其是重组蛋白质）的分离方面，双水相萃取技术还有待改进。
为了适应新的时代的需求，更加高效地进行生物工程技术中关键步骤的分离，本文根据对蛋白质研究的进展，采用了一种新型的蛋白质双水相萃取分离技术，探讨了各组分之间的相互作用及产物结构的变化情况。
经过几年的努力，已经发展了三代双水相萃取技术。
该技术是在中国科学院大连化学物理研究所的国家级科研项目支持下开发出来的，所采用的萃取介质是含有表面活性剂的磷酸盐。
在研究过程中，还进行了一些小试、中试以及产业化实验。
3种新型的萃取剂都是基于吸附原理设计的，如硝酸纤维素、微晶纤维素、氧化硅。
前两种虽然具有较大的比表面积，但是吸附性较差，萃取后容易解吸，所以不太适合双水相萃取。
而氧化硅材料的比表面积较大，表面张力小，并且具有良好的化学稳定性，可用于制备双水相萃取介质，克服了前两种萃取剂的不足。
同时，也是由于氧化硅的特殊结构，所以比表面积的变化对其性能的影响很大。
双水相萃取技术在分离_纯化中的应用(精)
第39卷第8期化工技术与开发 V ol.39 No.8 2010年8月 Technology & Development of Chemical Industry Aug.2010综述与进展双水相萃取技术在分离、纯化中的应用谭志坚,李芬芳,邢健敏(中南大学化学化工学院,湖南长沙 410083摘要:双水相技术是一种新型的液-液萃取技术,由于其条件温和、易操作等特点,目前已广泛应用于物质的分离、纯化。
本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用,并针对其未来发展趋势进行了展望。
关键词:双水相萃取;分离纯化;应用中图分类号:TQ 028.32 文献标识码:A 文章编号:1671-9905(201008-0029-07基金项目:国家自然科学基金(项目编号:20956001通讯联系人:李芬芳(1964,女,湖南邵阳人,教授,博士生导师,研究方向:植物活性成分提取及分离纯代,E-mail:lfflgg@收稿日期:2010-03-30与传统的分离技术相比,双水相技术作为一种新型的分离技术,因其体积小,处理能力强,成相时间短,适合大规模化操作等特点[1],已经越来越受到人们的重视。
Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合,发现了双水相现象。
双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE技术真正应用是在20世纪60年代,1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素,这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。
1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离,为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。
迄今为止,被成功应用于生物医药工程,天然产物分离纯化,金属离子分离等方面[4~6]。
因其广泛的应用性,已经发展成为一种相对成熟的技术,但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。
双水相萃取的原理及应用
双水相萃取的原理及应用1. 前言双水相萃取是一种常用的物质分离方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
本文将介绍双水相萃取的原理及其在不同领域中的应用。
2. 原理双水相萃取是利用两种不相溶的溶剂（通常为水和有机溶剂）之间的相互作用，以实现物质的分离和提取。
其原理基于分子之间的相互作用力，包括疏水性、极性和亲合力等。
2.1 水相与有机相的选择在进行双水相萃取实验时，选择合适的水相和有机相是十分重要的。
常用的水相溶剂有水、盐水等，而有机相溶剂则包括乙酸乙酯、正己烷等。
选择水相和有机相时需要考虑样品的性质、溶解度以及分离的目的。
2.2 萃取剂的选择萃取剂是进行双水相萃取的关键因素之一。
常用的萃取剂包括酸、碱、络合剂等。
通过选择不同的萃取剂，可以实现对不同种类物质的萃取和分离。
2.3 萃取过程双水相萃取的过程包括三个主要步骤：混合、均相化和相分离。
首先，将水相溶液、有机相溶液和适量的萃取剂混合，形成两相体系。
随后，通过剧烈搅拌等方法，使两相充分混合，进一步提高物质的分离效果。
最后，待两相达到平衡后，通过离心等方法使两相分离，获得所需的物质。
3. 应用双水相萃取在许多领域中具有广泛的应用。
以下列举了一些常见的应用领域。
3.1 化学分析双水相萃取可用于化学分析中的样品预处理。
通过选择合适的萃取剂和萃取条件，可以实现对样品中目标物质的浓缩和提取。
在质谱分析、气相色谱等分析方法中，双水相萃取常被用于样品前处理，提高分析的准确度和灵敏度。
3.2 生物制药在生物制药过程中，双水相萃取被广泛应用于蛋白质分离和纯化。
通过调节水相和有机相的条件，可以实现对蛋白质的特异性提取和纯化。
此外，双水相萃取还可以用于细胞培养液中目标物质的富集，提高生物药物产量。
3.3 环境监测双水相萃取可用于环境监测中对水体和土壤中的有害物质进行提取和分析。
通过调节萃取剂的种类和浓度，可以有效地提取出目标物质，实现对环境中的污染物的定性和定量分析。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取分离技术的研究进展及应用
双水相萃取分离技术的研究进展及应用1 前言近年来，随着分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物生产等方面应用的需求和发展，一种新型的液液分离技术—双水相萃取技术应运而生。
双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术，是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。
由于双水相萃取分离过程具有条件温和、可调节因素多、易于放大、可连续操作且不存在有机溶剂残留等优点，已被广泛用于生物物质的分离和提纯。
在1956年，瑞典的Albertsson 首次运用了双水相萃取技术来提取生物物质，开始对ATPS(双水相系统)进行比较系统的研究，测定了许多ATPS的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，为发展双水相萃取技术打下了坚实的基础。
目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，是一项拥有广阔应用前景的新型分离技术。
本文将就双水相萃取技术的原理、应用和发展情况作一简述。
2 双水相萃取原理双水相萃取与水—有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst[ 1]分配定律：K= C上/ C下（其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度）系统固定时，分配系数为一常数，与溶质的浓度无关。
当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。
如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0101，因此为物质分离提供了可能。
水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示，以PEG/ Dextran体系的相图为例(图1[2 ] )，这两种聚合物都能与水无限混合，当它们的组成在图1曲线的上方时(用M点表示)体系就会分成两相，分别有不同的组成和密度，轻相(或称上相)组成用T点表示，重相(或称下相)组成用B表示。
双水相的萃取原理及应用
双水相的萃取原理及应用双水相萃取是一种常用的分离纯化技术，其原理是将两种互不相溶的溶剂（一般是水和有机溶剂）在适当的条件下混合形成两个相，通过溶质在两相间的分配系数差异，使溶质转移到另一相中来实现分离纯化。
双水相萃取技术在生物医药、食品工业、环境监测等领域有广泛的应用。
双水相萃取的原理可以通过亲水基团和疏水基团之间的相互作用来解释。
当有机溶剂向水中注入时，溶剂分子中的疏水基团与水中的活泼基团（如羟基和胺基）发生作用，形成一层水合包裹层。
这种水合包裹层使有机溶剂和水发生互溶性差异，从而使两种溶剂形成不相容的两个相。
双水相萃取的应用可以归纳为以下几个方面：1. 生物活性物质分离纯化：双水相萃取广泛应用于生物活性物质分离纯化领域，例如从植物提取出天然产物（如植物提取物中的生物碱、黄酮、甾醇等）；从微生物培养液中提取酶、蛋白质等生物活性物质；海洋生物样品的提取等。
双水相萃取可以有效地分离目标物质并去除一些干扰性物质，提高目标物质的纯度和产率。
2. 蛋白质的分离纯化：双水相萃取可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质在不同的条件下会有不同的溶解度，通过调节溶剂的性质和条件，可以使目标蛋白质在双水相中的分配系数大于1，从而实现蛋白质的富集和分离纯化。
3. DNA/RNA的提取：双水相萃取也可用于DNA/RNA的提取。
DNA/RNA在某些条件下与有机溶剂形成复合物，可以通过双水相萃取的方法将DNA/RNA 从混合物中分离出来。
这是分子生物学研究中常用的一种DNA/RNA提取方法。
4. 药物研发：双水相萃取在药物研发中有着重要的应用。
药物研发中常常需要提取、分离纯化目标化合物，双水相萃取可以通过调节溶剂体系的性质和条件，实现对复杂混合物中目标化合物的分离纯化，从而提高化合物的纯度和产率，为药物研发提供了有效的手段。
除了上述应用外，双水相萃取还可以用于环境监测、食品工业等领域。
例如，在环境监测中，可以利用双水相萃取将有机污染物和水样分离，进而进行有机污染物的检测与分析。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(精)
化学与生物工程2006,Vol.23N o.10Ch emistry &B ioengin eerin g7收稿日期:2006-04-17作者简介:郑楠(1982-,女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。
E -mail:*********************。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究郑楠,刘杰(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029摘要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。
关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(200610-0007-03液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。
然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。
与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。
正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
1 双水相萃取原理双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。
高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。
双水相萃取分离蛋白酶
2、相 图
4、分配系数：
生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配 系数。
K=Ct/Cb
5、萃取因素与理论收得率
6、影响K的因素
影响分配系数的因素： 系统本身的因素：系统组成、聚合物分子量、聚
合物浓度、盐和离子强度、pH等。 目标产物的性质：疏水作用、电荷、分子量等。
（1）、PEG分子量 蛋白酶的分配系数随PEG分子量的增加而降低，在低
（一） 相图的绘制
1、两相物质的准备 上相：不同分子量的PEG（600，4000，6000，20000），
配制成原液或直接采用固体试剂； 下相：无机盐制成一定浓度原液，或采用固体试剂。 A、磷酸钾 B、硫酸铵 C、硫酸钠
2、操作
（1）取大试管一支，称重（W0）. （2） 准确称量一定重量的PEG原液，加入试管中，计 算出加入的PEG 的量（g）。
（4）、离子强度
例如：在相组成为PEG4000（15%w/w）磷酸盐 （10%w/w）时， 在较低NaCl浓度时，蛋白酶的分配系数随 NaCl浓度增加而减小，在1% w/w NaCl时达到最低，继续增 加NaCl浓度，蛋白酶的分配系数随NaCl浓度增加而增加，在 7.8% w/w时达到最大。继续增加NaCl浓度，蛋白酶的分配系 数又趋下降。这是由于Na+ 和Cl-在两相分配情况不同，从而 引起两相电位差的变化所致。
（三）扩展实验（选作）
如果你感兴趣，你还可以采用单因素实验或PB实验， 研究PEG分子量，pH值、酶液浓度、离子强度对K与收率 1-φ的影响，然后采用正交试验或响应面实验进行工艺优化。
4、从浑浊变澄清时，要注意“刚刚澄清”。
作业：
1、采用Excel 软件，在同一个图中绘出不同相系统 的双节线（相图）。
双水相体系配制与萃取实验报告
双水相体系配制与萃取实验报告一、实验目的本实验旨在掌握双水相体系的配制方法及其在萃取中的应用，了解萃取原理，熟练掌握萃取方法。
二、实验原理1. 双水相体系双水相体系是指两种不相溶的水溶液混合后形成两个互不混合的层。
常见的双水相体系有三种：乙醇-盐酸、聚乙二醇-硫酸和磷酸盐-硫酸。
其中以乙醇-盐酸为例，当乙醇和盐酸混合时，由于两者极性不同，无法完全混合，形成两个不同密度的液相。
2. 萃取原理萃取是利用不同物质在溶剂中的溶解度差异而进行分离纯化的方法。
常用于分离提纯化学物质或生物物质。
在双水相体系中，可以利用两个不同密度的液相进行分离。
三、实验步骤1. 配制双水相体系将10mL浓盐酸加入50mL 95%乙醇中，搅拌均匀。
2. 萃取实验将10mL橙黄色染料加入双水相体系中，轻轻摇晃容器使其混合均匀。
观察到橙黄色染料被分配到乙醇相中。
3. 分离两相用滴管吸取乙醇相，移至干燥的试管中。
用水洗涤滴管后再吸取盐酸相，移至另一个干燥的试管中。
4. 检测分离后的物质在乙醇相中加入少量氢氧化钠溶液，观察到橙黄色染料变成了蓝色。
在盐酸相中加入苯胺溶液，观察到产生了沉淀。
四、实验结果通过本次实验，成功配制出了乙醇-盐酸的双水相体系，并利用该体系进行了萃取实验。
观察到橙黄色染料被分配到乙醇相中，并成功分离两个不同密度的液相。
最终，在乙醇相中检测到了蓝色染料，在盐酸相中检测到了沉淀。
五、实验思考1. 双水相体系的应用有哪些？双水相体系可以用于萃取、分离和纯化生物大分子，如蛋白质、DNA和RNA等。
此外，还可以用于制备纳米材料、催化剂和药物等。
2. 萃取实验中为什么要加入氢氧化钠溶液和苯胺溶液？氢氧化钠溶液可以使橙黄色染料变成蓝色，从而检测出乙醇相中的染料。
苯胺溶液可以与盐酸反应产生沉淀，从而检测出盐酸相中的物质。
3. 双水相体系如何选择？选择双水相体系应考虑所需分离物质的性质和目标纯度。
不同双水相体系对不同物质有不同的选择性，因此需要根据实际情况进行选择。
双水相萃取技术的研究现状
双水相萃取技术研究进展[摘要]：双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视，与传统的萃取及其他分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物工程、药物分析和环境科学等方面，本文简单介绍了双水相萃取技术及其原理、特点，影响因素及其应用。
[关键字]：双水相萃取；分离；应用Aqueous two-phase extraction technology researchstatus[Abstra ct]:aqueous two-phase extraction technology as a new separation technology is becoming more and more attention, compared with the traditional extraction and separation technology other mild operating condition, the advantages of large capacity, easy to continuous operation, making it can be widely used in biological engineering, pharmaceutical analysis and environmental science, etc., this article simply introduces the aqueous two-phase extraction technology and its principle, characteristics, influence factors and its application.[key wo rds]: Aqueous two-phase extraction; Separation; application引言随着生物化工等新型学科的发展，一些含量较少、具有生理活性又极有机价值的生物物质的分离提纯，成了十分关键的技术课题。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
化学与生物工程2006,Vol.23No.10 Chemistry &Bioengineering7 收稿日期:2006-04-17作者简介:郑楠(1982-),女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。
E 2mail :zhengnan1982@ 。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究郑 楠,刘 杰(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029) 摘 要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。
关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素中图分类号:TQ 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2006)10-0007-03 液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。
然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。
与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5～15min ;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。
正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
1 双水相萃取原理双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。
高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。
蛋白质分离纯化方法的研究进展
蛋白质分离纯化方法的研究进展一、本文概述蛋白质是生物体内最重要的一类大分子化合物，它们在生物体内发挥着多种关键功能，包括酶催化、信号转导、基因表达调控等。
因此，对蛋白质的研究一直是生物医学领域的热点之一。
蛋白质的分离纯化是蛋白质研究的基础，也是后续蛋白质功能研究、结构解析和药物研发等工作的前提。
随着科技的进步和方法的创新，蛋白质分离纯化技术也在不断发展。
本文旨在综述近年来蛋白质分离纯化方法的研究进展，包括传统的分离纯化方法以及新兴的技术，以期为蛋白质研究领域的同仁提供参考和启示。
我们将首先回顾传统的蛋白质分离纯化方法，如凝胶电泳、色谱分离、超速离心等，这些方法在过去几十年中得到了广泛应用，但其分辨率和效率仍有待提高。
接着，我们将重点介绍近年来新兴的蛋白质分离纯化技术，如亲和层析、离子交换层析、反向液相色谱等，这些技术具有更高的分辨率和更好的纯化效果，为蛋白质研究提供了新的有力工具。
我们还将讨论一些新兴的跨学科技术，如纳米技术、生物信息学等在蛋白质分离纯化中的应用，这些技术为蛋白质分离纯化带来了新的机遇和挑战。
我们将对蛋白质分离纯化方法的发展趋势进行展望，以期为未来蛋白质研究提供指导。
我们相信，随着科技的进步和方法的创新，蛋白质分离纯化技术将会更加完善，为蛋白质研究领域的深入发展奠定坚实基础。
二、传统蛋白质分离纯化方法传统蛋白质分离纯化方法主要依赖于蛋白质的理化性质差异，如溶解度、分子量、电荷、疏水性等。
这些方法虽然历史悠久，但在许多情况下仍然被广泛应用，因为它们通常操作简单、成本较低，并且对于某些特定类型的蛋白质具有良好的分离效果。
盐析法：这是最早使用的蛋白质纯化方法之一。
通过调整溶液中的盐浓度，可以降低蛋白质的溶解度，从而实现蛋白质的沉淀。
这种方法常用于蛋白质的初步分离，但纯度通常不高。
有机溶剂沉淀：某些有机溶剂可以降低溶液的介电常数，从而改变蛋白质表面的电荷分布，导致其溶解度降低。
这种方法常用于去除样品中的杂质。
双水相萃取技术的研究进展及应用
述———————瓦丽而矿垒盟双水相荸取技永的研舞进展及硅用ｉ江咏。
李晓玺，李琳，胡松青（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州５ｌｏ“ｏ）摘要：夼绍了双水相革取技术（ＡＴＰＥ）的应用现状，综述了近年来取水相萃取技术的相关研完进展。
针对双水相系统（ＡＴ鸭）的经济适用性问题，对新型ＡＴＰｓ相组成材料的研究取得了极大的发展；为了提高双水相萃取技术的选择性争分毒效率，在组成传统Ⅳｌ＿皓的聚合物上偶联亲和配基的亲和Ａ什ｓ也得到关注；越水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以厦革职机理和鹅力学模型的优化上。
美羹词：双水相革卑．蛋白质，分离纯化＾ｂｓ打ａｄ：Ｔｈｅａｐｐ｜ｉｃａｔｉｏｎｓ。
ｆｔｈｅａｑｕｅｏｕｓｔｗ０一ｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｌｏｎ（ＡＴＰＥ）ｍｔｈｅ８ｅｙｅａｒｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｎｚｅｄ，ａｎｄ廿１ｅａｄｖａｎｃｅｓＯｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈ０ｆＡＴＰＥｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄＴｈｅｎｄｖｅｌａｑｕｅｏｕｓｔｗｏ—ｐｈ船ｅｓｙｓｔｅｍｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｕｓｌｎｇｔｈｅｃｈｅａｐｅｒｐｈａｓｅｆＯｒｍＩｎｇｐＯｌｙｍｅｒｌｎＯｒｄｅｒｔｏｉｍｐｒｏｖｅｆｈｅ∞ｌｅｃｔｌｖ时ａｎｄｓｅｐａｒａｔｌｏｎｅ衔ｃＩｅｎｃｙ，ｉｈｅａ卅Ｉｎ时ｅｘｔｒａｃｔｂｎｕｄｎｇａｑｕｏｏｕｓｎⅣ０一ｐｈａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＴＰｓ）ｗｈｌｃｈ呲ｓ甜ｌｎｉ【ｙ¨ｇａｎｄｔ。
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双水相萃取技术在分离_纯化中的应用
第39卷 第8期 化 工 技 术 与 开 发 V ol.39 No.8 2010年8月 Technology & Development of Chemical Industry Aug.2010综述与进展双水相萃取技术在分离、纯化中的应用谭志坚，李芬芳，邢健敏（中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083）摘 要：双水相技术是一种新型的液-液萃取技术，由于其条件温和、易操作等特点，目前已广泛应用于物质的分离、纯化。
本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用，并针对其未来发展趋势进行了展望。
关键词：双水相萃取；分离纯化；应用中图分类号：TQ 028.32 文献标识码：A 文章编号：1671-9905(2010)08-0029-07基金项目：国家自然科学基金（项目编号：20956001）通讯联系人：李芬芳(1964)，女，湖南邵阳人，教授，博士生导师，研究方向：植物活性成分提取及分离纯代，E-mail:lfflgg@收稿日期：2010-03-30与传统的分离技术相比，双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点[1]，已经越来越受到人们的重视。
Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象。
双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE)技术真正应用是在20世纪60年代，1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。
1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离，为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。
迄今为止，被成功应用于生物医药工程，天然产物分离纯化，金属离子分离等方面[4~6]。
因其广泛的应用性，已经发展成为一种相对成熟的技术，但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。
蛋白质双水相萃取
蛋白质双水相萃取
双水相萃取在近年来变得越来越流行，因为它擅长在复杂的生物体中分离和纯化蛋白质。
大多数基于水的萃取系统是各种中性、弱酸性或弱碱性的溶液混合体。
然而，双水相萃取技术可以一次在石蜡中溶解蛋白质，然后用交叉连通的双水相去极化蛋白质。
它可以在低浓度有机溶剂中迅速准确地实现蛋白质的萃取和纯化，从而使它成为从某些反应中获取蛋白质的最佳方法。
双水相萃取最常用于细胞膜蛋白质分离和纯化，该溶液系统改变了细胞膜蛋白质的结构，从而使其可以被双水相进行分离和纯化细胞膜蛋白质的分离和纯化。
双水相的介质有效地在细胞膜上形成一个剥落层，同时可以将细胞膜蛋白质引入有机相，之后由相变过程和物理机械过程实现有效分离细胞膜蛋白质。
此外，由于双水相极化体中的蛋白质能够免受某种特定的非电解质的影响，所以使其能够有效地净化蛋白质，分离和纯化的效率也更高。
双水相萃取技术不仅被广泛应用于蛋白质分离纯化，它也可用于制备抗体和抗原，用于药物合成研究。
此外，它还可以用于提取非蛋白性寡核苷酸，用于制备营养状态血液检测，并发挥重要作用。
总而言之，双水相萃取技术不仅使蛋白质分离纯化简单快速、高效稳定，而且在抗体和抗原的制备、数据储存和原料供应上也表现出了卓越的能力。
它是一种新兴的高效技术，可以在各种领域得到广泛应用，为特定领域的研究提供有效支持。
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化学与生物工程2006,Vol.23N o.10Ch emistry &B ioengin eerin g7收稿日期:2006-04-17作者简介:郑楠(1982-),女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。
E -mail:zheng nan1982@ 。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究郑 楠,刘 杰(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029)摘 要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。
关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2006)10-0007-03液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。
然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。
与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。
正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
1 双水相萃取原理双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。
高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。
当生物物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10之间),因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。
2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素211 聚合物的分子量同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1],当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。
如在PEG -Dex tr an 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dex tran 的分子量减小会使分配系数变小。
这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相分配。
同理,Dex tran 的疏水性随其分子量的增大而增强,使蛋白质在下相的表面张力增大,从而不断向上相分配。
212 聚合物的浓度在双水相系统中,界面张力很低并且随结线长度呈指数规律的增大。
当系统组成处于临界点时,系线长度为零,上下相组成相同,蛋白质均匀地分配在两相中,分配系数K =1。
当成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时,系统远离临界点,系线长度增大,两相性质的差别也增大,同时蛋白质在两相中的界面张力差别增大,使其趋于向一侧分配,即K 值或增大超过1,或减小低于1。
213添加剂21311中性盐盐的种类对分配系数的影响主要反映在对相间电位的影响上[2]。
中性盐的种类不同,其正负离子分配系数也不同,当它在双水相中电离时,为保持两相的电中性,产生了不同的相间电位,从而影响蛋白质的分配。
如在PEG-Dextran体系中加入NaClO4或KI,可增加上相对带正电的蛋白质的亲和效应,并迫使带负电的蛋白质进入下相;若加入Li3PO4情况则相反[1]。
故只要改变界面电势就可控制荷电蛋白质转入所需要的相中。
盐的浓度对分配系数的影响主要反映在对蛋白质疏水性的影响上[2]。
如U fuk Gunduz和Konca Korkmaz用PEG3350-Dextran35000体系分配BSA 时,保持体系N aCl浓度不等(0106mol#L-1、011mo l#L-1、012mo l#L-1、013m ol#L-1、0134mo l#L-1),发现在任一pH值下,随着NaCl浓度的增加,分配系数先减小后增大,且在012m ol# L-1处达到最小。
这是由于BSA在上下相的相对疏水性随NaCl浓度的变化呈先大后小的趋势,当NaCl 浓度为012m ol#L-1时达最大,分配在下相的BSA也就最多,因而分配系数最小[3]。
21312有机溶剂在双水相体系中添加少量有机共溶剂,使得体系中的一部分水被有机共溶剂所取代,导致两相界面处的疏水性能差异发生变化,同时界面张力以及电位差也随之改变,从而影响了蛋白质的分配[4]。
通常认为,有机共溶剂对被分配物质分配行为的影响更主要是有机溶剂和成相高聚物相互作用的结果[5]。
如在PEG4000-Dex tr an40000体系中分别加入相同量(2%)的乙醇、异丙醇、丙酮,均使BSA的分配系数显著降低,且加入乙醇后分配系数达到最小。
这一现象完全符合以上理论:由于乙醇有较大的水化能,体系中的水较多地被乙醇所取代,使两相界面处的疏水性能差异、界面张力以及电位差较其它有机溶剂大,因此蛋白质分配系数的变化较大;再者乙醇与PEG相相互作用较强,使得蛋白质受排斥而易于向Dextran相富集。
21313表面活性剂Bodhankar和Gaikar等研究了四类表面活性剂,即阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂在PEG-Dex tr an体系中对物质分配的影响。
实验表明,添加表面活性剂可以改变界面张力、上下相组成等两相特性,从而对物质的分配行为进行调节[6]。
214pH值体系pH值会影响蛋白质分子可离解基团的离解度,从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配。
同时pH值还会影响缓冲离子如H PO2-4、PO3-4等的分配,以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。
另外在研究分配系数与pH值的关系时,若加入不同种类的中性盐,由于电位差的不同,其相应关系也不同[1]。
215温度温度的变化影响相物理性质的变化,例如粘度和密度等,从而影响蛋白质的分配[7]。
但总的来说,温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的。
在临界点附近,温度对相图的影响最显著,对分配系数的影响最强。
当远离临界点时,温度对相图的影响较小,分配系数对温度的变化也不敏感。
这是由于远离临界点时,成相聚合物的浓度增大,对蛋白质的稳定作用增强。
216荷电PEG作为成相聚合物在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差,故可在PEG或葡聚糖上引入带电基团来改变蛋白质的分配。
因相间电位差与电荷数成反比,而每个葡聚糖分子上可引入的带电基团较多,故效果较差。
相反,每个PEG分子只含两个羟基,只需引入两个荷电基团,电场增大的效果就较好。
Johansson等已制得以下四种荷电PEG:带正电的三甲胺基-PEG(TM A-PEG)、氨基-PEG(PEG-NH2)和带负电的PEG-磺酸盐(S-PEG)、羧基-PEG(PEG-COOH)[8]。
因此可以根据蛋白质的带电情况来选择荷电PEG,以达到改变蛋白质分配的目的。
如红血球蛋白在pH值较小时带正电(等电点为7),若将PEG接上三甲胺基基团后,由于上相带正电,红血球蛋白就不断向下相富集;同理,当pH值较大时,由于受上相正电T MA-PEG的影响,带负电荷的红血球蛋白则开始向上相富集。
217疏水基团在聚合物上接枝疏水基团后,疏水性成为影响蛋白质分配的主要因素。
这种疏水性的影响由连接在高聚物上疏水基的大小和蛋白质分子疏水区域的数量以及疏水区的粘结强度所决定。
Shanbhag和A xelsson 认为,通过比较蛋白质在PEG-Dextran体系和存在部分P-PEG(Palmitoy-l PEG)的PEG-Dex tran体系中的分配系数,可以衡量蛋白质的疏水性。
实验表明,在P-PEG浓度很低的情况下,血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非极性的P-PEG结合,所以不断向上相富集[8]。
218亲和配基在聚合物上接上一定的亲和配基,不仅能提高萃取分配的专一性,而且能增大处理量。
例如:NADH-PEG衍生物引入PEG-Dex tran体系后使乙醇脱氢酶的分配系数与其分子上结合位点数密切相关;另Ciba-cronblue-PEG衍生物引入PEG-Dex tran体系后使磷酸果糖激酶的分配系数成千倍地提高。
也可同时使用以上两种配基,从而增加系统的选择性,完成多种酶的分离和回收[7]。
3双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用和展望双水相萃取技术已成功地用于分离和提纯蛋白质、提取抗生素和分离生物粒子、电泳分离氨基酸等方面。
双水相萃取分离技术还有很多可开拓的领域:(1)新型双水相体系的开发。
新型双水相体系主要有两类:廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系。
廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物。
例如:牌号PPT的变性淀粉和牌号为Reppa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等[9]。
研究发现由这些聚合物形成的双水相体系的相图与PEG-Dextran 形成的双水相体系相图非常相似,其稳定性也比PEG-盐双水相体系更好,并且具有蛋白质溶解度大、粘度小等优点[10]。
另外,特别要提到只有一种成相聚合物的新的双水相体系,上相几乎100%是水,聚合物绝大部分集中在下相,该体系不仅操作成本低、萃取效果好,还为蛋白质等生物物质提供了更温和的环境[11]。
(2)后续色谱纯化工艺研究。
高聚物/高聚物双水相萃取同离子交换层析技术结合可以解决双水相萃取技术在蛋白质粗分离纯化中的工业化问题。
PEG-盐体系具有价廉和分相容易的优点,而疏水色谱可在高盐浓度下操作,故PEG-盐体系与疏水色谱的结合有很大的发展空间。
如Schutte已成功利用疏水色谱从盐相中分离纯化蛋白质。
(3)金属亲和双水相萃取技术。
金属亲和双水相萃取和普通亲和双水相萃取相比,具有亲和配基价廉且再生容易、可用于PEG-盐体系的优点。
Ar nold提出了金属离子亲和双水相萃取技术,利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用,以达到分离纯化蛋白质的目的。
目前金属离子亲和双水相萃取已应用于多种酶的分离纯化。
影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用及界面张力等。