质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

③ 72℃ 8 分钟；
④ 4 ℃ 保温。 实验过程约1小时30分钟
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （30s）
形 成 DNA 2
循环2
循环3
72 50
条变 单性 链
50 ℃退火 （30s） 子链延伸
DNA加倍
72 ℃延伸 （60s）
DNA单链 与引物复 性
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和 反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性 30s， 50℃退火30s， 72 ℃延伸60s。如此周而复始，重复 进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
原理示意图
5
Template DNA
5
5 Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
•（五） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；
Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
①变性温度与时间
技术，通过测定荧光强度来对
PCR产物进行实时定量。
PCR相关技术
优点：起始定量
PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA的序列测定 （五）基因的突变分析
PCR的临床应用
遗传病的诊断：β-地中海贫血诊断、产前诊断、肝 癌研究、α-1抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛 风病等诊断研究
附蛋白质、多糖等物质；
通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其 它细菌成分去除；
低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净
质粒DNA从硅基质膜上洗脱；
四、实验步骤
1. 2. 3. 4. 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 9000rpm×30 s，弃上清 加入250μl 溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 加入250μl 溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡）， 直到溶液变得清亮. 5. 加入400μl 溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。 13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl ）。 6. 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱 中，13000rpm离心3min，弃滤液。 7. 加入500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液， 8. 向吸附柱中加入500μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ， 弃滤液。 9. 重复步骤8一次。 10. 空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3-5min，使残留 乙醇挥发。 11. 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间 加60μl-100μl洗脱缓冲液Eluent，室温放置1min， 13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用。
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖 上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。
四、结果分析
1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定; 2、加5uLPCR产物进行电泳;
3、预期PCR产物大小约400~500bp;
五、实验原理
* 由1985年穆里斯（K.
质粒DNA的酶切分析
在一个洁净的1.5
反应物 无菌去离子水
ml离心管中混匀下列反应物： 体积（µ l) 10.0
10×dIII 质粒DNA
1.0
1.0 6.0
总计 20ul
混合后37℃水浴1-2h。用酶切产物进行电泳
注意事项：不要有气泡，并尽量使液体在离心管底部。
变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。 变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚 合酶的活性， 变性温度90-95 ℃为宜。
②退火温度与时间：
复性温度决定着 PCR 的特异性。温度越低复性越好， 升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数 PCR 反应的 复性温度在 35－70℃,一般低于引物Tm值的5℃左右。 复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。
（三）Taq 酶
•从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出
的热稳定性 DNA 聚合酶 •酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果 酶的浓度太高则会出现非特异性扩增 每 100μl 反应液中含 1-2.5U Taq DNA 聚合酶为佳 •保存：-20 ℃
（四）dNTP • dNTP浓度取决于扩增片段的长度 • 四种dNTP浓度应相等 • 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量 • dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖 上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。
一、实验仪器
仪器: PCR仪(BioRad MJ mini) 台式离心机
灭菌的薄壁离心管
凝胶电泳系统等
凝胶成像系统
2、离心层析柱
硅基质膜在高盐、低pH值状态下选 择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸
• 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子；
• 基因工程常采用的 载体
方法：
碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法； 酸酚法 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行 处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离、纯化质粒DNA
景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则
产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减 少循环次数。
• 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。
PCR相关技术
PCR相关技术
荧光定量PCR（real-time PCR）
融汇PCR技术、DNA探针杂交技
术（标记有荧光报告基团与荧
光淬灭基团），结合先进的光 谱检测技术发展起来的一项新
取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试 剂(注意每换一种试剂换一个新吸头,且PCR反应管标记在侧面)：
灭菌去离子水 2*Premix 正向引物-SO100 (10M) 反向引物-SO101 (10M) 菌液：
19 l 25l 2l 2l 2l
总体积
50l
GT 3’
ATG AC3’
Taq酶：5U/μl
4×dNTP: 10mM each 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3)
MgCl2: 25mM
4、灭菌去离子水
三、实验步骤
① 94℃预变性2 分钟后开始以下循环
② 94℃ 30 秒
55℃ 30 秒 72℃ 60 秒 30 循环
③延伸温度与时间：
引物延伸温度一般为 72℃ 。 延伸时间：72℃ 时，核苷酸的合成速度为 35-100 个核苷酸 /S ， 这取决于缓冲体系、 pH 、盐浓度和 DNA 模板的性质。 然而，延 伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。
• PCR循环次数
• 循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背
二、实验原理
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。 在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的 大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条 互补链不会完全分离。 当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变 性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中， 而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通 过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋 白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
生物识别：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙 肝病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）等十几种病 毒检测
癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增， 可协助对肿瘤的诊断。
质粒DNA的提取与定量
Extraction and Quantitation of Plasmid DNA
一、什么是质粒？
Mullis）发明，他也因此获得了 1993年的诺贝尔化学奖。 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复 制DNA的过程。
实验原理
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
定性的作用 •引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增 加引物二聚体的形成 一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 ～ 1μmol/L 为宜 •引物的设计：使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等
引物的设计原则：
二、实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法
• 了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原 理和测定方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的 构型、分子量的大小 • 掌握PCR基因扩增的原理和操作方法
聚合酶链式反应(PCR)
Polymerase Chain Reaction
质粒DNA的提取、定量、 酶切与PCR鉴定
一、实验流程
简述实验内容流程，PCR操作步骤 ↓ 煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温） ↓约2小时收集PCR产物 学习PCR原理
质粒DNA提取（约1小时） ↓ 紫外检测定量知识（计算方法），步骤 ↓ 紫外检测定量 ↓ 酶切步骤 ↓ 酶切约1~2小时 ↓ 学习酶切原理，琼脂糖电泳原理 ↓ 电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker） ↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存

(一)模板DNA •PCR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体
外扩增。
•模板的浓度要适当
基因组DNA：50-100 ng
质粒DNA: 5-10 ng
(二)引物 与摸板DNA链互补的小片段DNA分子； PCR特异性反应的关键；
引物1
引物2
引物的特异性：引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决
5
5
5
5
Cycle 2
5 5 5 5 5 5 5 5
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量可以 扩大100万倍以上。
PCR 反应系统的组成 模板DNA 引物 dNTP 耐热的 DNA聚合酶 缓冲液
一、实验仪器
仪器: PCR仪(BioRad MJ mini) 台式离心机
灭菌的薄壁离心管
凝胶电泳系统等
凝胶成像系统
二、试剂
1、 菌液：DNA模板(含靶基因片段)
2、引物： 正向引物： 5’ GTA AAA
反向引物: 5’ CAG 3、2×Premix ： GAA
CGA CGG CCA
ACA GCT
• • • • • • • 1、引物长度：15~25个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。 2、 (G+C）%含量:40%~60%。 并且，两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 3、两个引物之间配对碱基数小于5个。 4、引物自身配对的碱基对数不大于3。特别是在引物3’端。 5、引物与模板非特异性配对为点的碱基配对率小于70%。 6、Tm值高于55℃
取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试 剂(注意每换一种试剂换一个新吸头,且PCR反应管标记在侧面)：
灭菌去离子水 2*Premix 正向引物-SO100 (10M) 反向引物-SO101 (10M) 菌液：
19 l 25l 2l 2l 2l
总体积
50l