植物愈伤组织诱导培养基的配制

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告
姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制
一 .实验目的
1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。

2、掌握植物MS 培养基的配制方法。

3、学会使用高压灭菌锅。

学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定
二 .实验原理
概念：
1.植物组织培养：
将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

2.愈伤组织及脱分化、再分化：
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。

培养基配置见下表
化合物
含量
mg/L
母 液
吸取母
液量 ml/L 编号
浓度
mg/ml
称量
mg 配制量
ml
NH 4NO 3 1650 1
33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O
440
2 8.8
4400
500
25
三 .主要仪器试剂
三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4•7H2O 、CaCl2•2H2O 、 ZnSO4•7H2O 、MnSO4•4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。

四.实验操作步骤
1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处
a.可减少每次配制称量药品的麻烦.
b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。

母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。

（2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。

2）实验中用到的各母液
ZnSO 4.7H 2O 8.6 3
0.86 430 500
5
MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62
310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4
0.25 125 500
0.5
CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025
12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸
0.5
11
1
25
25
0.25
（1）大量元素混合母液：指浓度大于0.5 mmol／L的元素，即含N、P、K、Ca、Mg、S 等六种盐类的混合溶液，可配成10倍母液。

【注意事项】
a.各化合物必须充分溶解后才能混合。

b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。

c .混合时要慢，边搅拌边混合。

（2）微量元素混合母液：指浓度小于0.5 mmol／L的元素，即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等盐类的混合溶液。

一般配成100倍甚至1000倍。

（3）铁盐母液
（4）钙盐母液：必须单独配制，若同其他无机元素混合配成母液，易造成沉淀。

（5）有机营养母液：主要是维生素和氨基酸类物质。

必须分别配成单独的母液。

0.1、1.0、10 mg/ml。

（6）植物激素：单独配制成母液。

0.1、0.5、1.0mg /ml。

a. IAA、IBA、GA3先溶于少量95%酒精，再加水定容。

b. NAA可溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定容。

c. 2,4－D不溶于水，可用1mol NaOH溶解后，再加水定容。

d. KT和6-BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容。

e. 玉米素先溶于少量95％酒精中或NaOH，再加水定容。

2、MS培养基的配置
（1）向洗净的大搪瓷缸加三蒸水至大约400ml；
（2）将储存母液按顺序摆放好；
（3）按照配方并根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液；
（4）加入2，4-D(2mg/L)；
（5）称取加入蔗糖(浓度3%)，调节pH至5.7-5.8【此时可以偏酸抵消加热后的酸度偏差】；（6）加入琼脂（8-9g/L）加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源（第一个大气泡从缸底上升顶破泡沫层），趁热分装在100ml的三角培养瓶中（一般以容器的1/3～1/4体积为宜），拧紧瓶盖。

（7）放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm-2，121℃保持15～20分钟即可。

3、培养基的存放
经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。

暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。

五.思考题解答与讨论
1.培养基配制应注意哪些问题？
答：
①用于配制培养基的水最好是三蒸水。

②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。

③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。

④对于吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等遇热不稳定的生物活性物质，不能进行高压蒸气灭菌，因此在配制含有此类物质的培养基时，要分步进行：
⑤事先准备好已灭菌的滤器（加滤膜）及装无菌溶液的瓶子，将配制好的吲哚乙酸等溶液在无菌条件下进行抽滤；
2.培养基灭菌冷却后不凝固，请分析原因并提出解决办法。

答：不凝固原因可能是培养基在配制时调节pH偏酸，或者是在加热时使pH下降，造成过酸，使培养基不能凝固。

另外，也有可能是加热时不到火候，琼脂还没彻底化开，这样也是不会凝固的。