原生质体融合技术的研究进展

• 不足之处：
– 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生， 增加重组体 分离筛选的难度。
二、原生质体融合的步骤和方法
原 生 质 体 融 合 步 骤
1、亲本及遗传标记的选择
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。 • 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。 • 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
28-37 28-37
7.5-8.5
一类是盐溶液系 统，包括NaCl、 KCl、MgSO4、 CaCl2，浓度为0.3 ~ 1.0mol / L；
放线菌
glucuronidase 1%-2%
纤维素酶、 酵母裂解 酶、β-1,3 葡聚糖酶、 几丁质酶、 蜗牛酶 lywallzyme 1.5% snailase 10-30 时间较长
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。 • 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。
放线菌
1000~6000
20
l ~ 60 min，
一般 30% ~ 50%
4000~6000 真菌 链霉菌：1000
大多数情 况下为l ~ l0 min 30
某些远源关 系的菌株融 合后融合子 重组染色体 不稳定，容 易发生分离 现象
5、融合体的检出与分离
• 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二 倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体 的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的 不同加以选择。 ① 利用营养缺陷型标记选择融合体 ② 利用抗药性选择融合体 ③ 利用灭活原生质体检出融合体 ④ 利用荧光染色法选择融合体 ⑤ 双亲对碳源利用不同而检出融合体 ⑥ 利用形态差异检出
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。 • 陈洪雷等（2011）以供试菌Pseudomonas putida和Psathyrella candolleana 为出发菌株进行原生质体融合实验，将筛选到 的重组菌用于处理五氯酚 (PCP) 合成废水以检测重组菌的氯 代酚降解性。结果显示， Xz6-1 的 PCP 去除率为 75 ． 98 ％， 其PCP降解能力较亲本Preudomonas putida提高了21．7l％。
4、原生质体融合
原 生 质 融 合 过 程
4、原生质体融合
• 原生质体融合的影响因素
菌体种类 融合剂PEG的 相对分子量 融合剂 PEG的 浓度 融合时间 融合温度 （℃）
融合菌株间 的亲和力
无机离子
细菌
1500~6000
4 、20 Ca2 + 、Mg2 + 促进融合， 而K+ 、Na + 会显著降低 融合率。 融合时， Ca2 + 0 . 0l mol / L、 Mg2 + 0 . 02 mol / L最佳
真菌
30-35
5.5
一类是糖溶液系 统，包括蔗糖、 甘露醇、山梨醇、 木糖、纤维二糖、 鼠李糖等3、原生质体的再生源自• 原生质体再生的影响因素
1. 2. 3. 4. 5. 6. 培养基 稳定剂 酶解浓度和时间 再生方式 原生质体密度 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等
4、原生质体融合
4、原生质体融合
– 杂交频率较高 霉菌与放线菌的融合频率为10-3～10-1，细菌与酵母的 融合频率亦达到10-3～10-6 – 受接合型或致育性的限制较小 任何一株都可能起受体或供体 ，有利 于不同种属间微生物的杂交 – 重组体种类较多 – 遗传物质的传递更为完整 – 可获得性状优良的重组体 – 可提高育种效率 – 可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株
三、微生物原生质体融合的应用
• 改良菌种遗传特性
• 苏云金杆菌以色列变种 （ Bacillus thuringiensis subsp ． israeleusls）产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云 金 杆 菌 库 斯 塔 基 变 种 （ Bacillus thuringiensis subsp ． kurstaki HD—I ）产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将 这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆 虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。（2008） • 宋赵依等（2011）以非致病性尖镰孢F047和对西瓜枯萎菌 有抑制作用的植物内生放线菌 SG2、生长较快并对尖孢镰 孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生 质体融合，经筛选获得的融合子生长速率和对多菌灵抗药 性均优于F047菌株。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（ 2009 ）以红霉素高产茵 HE-08-6 及低产优组分茵 HA-08-20 为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本 HA-08-20 的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。 • 吴 萍 等 （ 2012 ） 以 刺 糖 多 孢 菌 CB11 （ Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合 子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S． spinosa CB11(产量为153 g／mL)提高了89．5 %。
原生质体融合技术的研究进展
主要内容
一
二 三 四 概述 原生质体融合的步骤和方法
微生物原生质体融合的应用 前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞
器、细胞骨架系统及胞基质)和细
胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。 • 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
一、概述
• 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的 基因重组技术。 • 原生质体融合：也称细胞杂交、细 胞融合或体细胞杂交，是指细胞通 过介导和培养，在离体条件下用人 工方法将不同种的细胞通过无性方 式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程。
• 与常规杂交相比，原生质体融合具有的优势：
2、原生质体制备
制 备 流 程
• 原生质体制备的影响因素
菌体种类 菌 龄 酶的种类 酶的浓度 （mg/mL）
酶解 时间 (20min7h)
时间较短
酶解温度 （℃） (一般为 35℃-37℃ 或45℃）
PH
渗透压稳定剂
细菌
溶菌酶 裂解酶 溶菌酶 对 数 生 长 中 后 期 lysozyme 0.1-0.2
三原生质体融合的应用?在污水工程菌构建上的应用?许燕滨等2005采用原生质体融合技术将两株具有含氯有机化合物降解特性的菌假单胞菌采用原生质体融合技术将两株具有含氯有机化合物降解特性的菌假单胞菌tl和诺卡氏菌rb1融合构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌应用于造纸漂融合构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌应用于造纸漂白废水融合菌去除cod和tcl的能力比混合菌分别提高白废水融合菌去除codcr和tcl的能力比混合菌分别提高了7205和190
谢谢大家！
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育优良的菌种
• 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。
• 彭帮柱（ 2006 ）等以酿酒酵母 1605 和苹果酒酵母 E2 为 亲本，通过原生质体融合，得到融合子 8# 菌株，具有 产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。 • 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒 酵母（ S.cerevisiae ）菌株 R1 进行复合诱变和原生质体 融合。实验采用酶解法获得出发菌株 S.cerevisiae R1的 单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得 菌株与出发菌株相比SAM产量提高了103 %。