肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810639633.5
(22)申请日 2018.06.20
(71)申请人 淮安诺康生物科技有限公司
地址 223005 江苏省淮安市淮安经济技术
开发区小康城四区60号
(72)发明人 何英广　马思航　
(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
(54)发明名称肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法(57)摘要本发明公开了肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法，步骤为：步骤S1、TIL细胞分离：取癌旁组织剪碎浸入胶原酶溶液消化，过滤，PBS冲洗，收集滤液，离心，弃上清，加入PBS制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心，离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的培养基内培养，每3～5d换液一次；步骤S2、培养和扩增：当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含抗CD3单抗、抗CD28单抗和药物的培养瓶内孵育，24h后加入IL-2连续培养，每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜培养基
培养22～25d。

权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 108753718 A 2018.11.06
C N 108753718
A
1.一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，其特征在于：正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤S1、TIL细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm 3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。

消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。

细胞滤液在常温下离心，1500r/min ×5min。

弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。

离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL -2的X -VIVO -15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO 2培养箱内培养，每3～5d换液一次。

步骤S2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL -2，置于37℃、5％CO 2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL -2的新鲜X -VIVO -15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S1中IL -2的浓度为2000IU/mL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD3单抗浓度为20ng/mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：抗CD28单抗浓度为20ng/mL。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：曼宋酮C或曼宋酮G的浓度为20μg/mL。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤S2中IL -2的浓度为4000IU/mL。

8.一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，其特征在于：通过在X -VIVO -15培养基中添加20μg/mL的曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。

9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：还含有20ng/mL的抗CD3单抗。

10.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：还含有20ng/mL的抗CD28单抗。

权　利　要　求　书1/1页CN 108753718 A
肿瘤浸润淋巴细胞TIL的体外扩增方法
技术领域
[0001]本发明属于生物领域，涉及一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法。

背景技术
[0002]免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。

2010年，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。

[0003]肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。

其主要成分是存在于肿瘤间质内的T淋巴细胞，小部分为MHC非限制性的NK细胞，其共同特征为表达T细胞受体(T cell receptor，TCR)。

TIL来自肿瘤组织区域，可特异识别自体肿瘤，具有特异的MHC限制性溶解肿瘤活性。

美国NCI的Rosenberg等首次证实，从实体瘤组织分离的TIL在体外经IL-2激活并大量扩增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治疗，其治疗效果远远高于之前发展的LAK(lymphokine activatedkiller cells)细胞治疗技术(文献：Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials.J Immunol Methods 1987)。

近年发表的多篇临床试验报道显示，TIL细胞免疫治疗可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分显示出TIL作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献：A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science 1986)。

[0004]但是，目前体外扩增TIL的方法存在两点不足：
[0005]第一，扩增效率不高，限制了肿瘤患者TIL的大量回输使用；
[0006]第二，对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高，回输肿瘤患者体内后对肿瘤的杀伤力不足。

发明内容
[0007]本发明旨在克服现有技术不足，提供一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，一方面提高TIL细胞的扩增效率，另一方面提高其对肿瘤细胞的杀伤力。

[0008]本发明技术方案如下：
[0009]一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养基孵育24h。

[0010]优选地，具体步骤为：
[0011]步骤S1、TIL细胞分离
[0012]取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。

消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。

细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。

弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度
梯度离心。

离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。

[0013]步骤S2、培养和扩增
[0014]当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。

[0015]优选地，步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。

[0016]优选地，抗CD3单抗浓度为20ng/mL。

[0017]优选地，抗CD28单抗浓度为20ng/mL。

[0018]优选地，呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B的浓度为20μg/mL。

[0019]优选地，步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。

[0020]一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的呋喃天竺葵酮A或呋喃天竺葵酮B配制而成。

[0021]优选地，还含有20ng/mL的抗CD3单抗。

[0022]优选地，还含有20ng/mL的抗CD28单抗。

[0023]一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养基孵育24h。

[0024]优选地，具体步骤为：
[0025]步骤S1、TIL细胞分离
[0026]取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。

消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。

细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。

弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。

离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。

[0027]步骤S2、培养和扩增
[0028]当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。

[0029]优选地，步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。

[0030]优选地，抗CD3单抗浓度为20ng/mL。

[0031]优选地，抗CD28单抗浓度为20ng/mL。

[0032]优选地，益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B的浓度为20μg/mL。

[0033]优选地，步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。

[0034]一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添
加20μg/mL的益智仁萜二醇A或益智仁萜二醇B配制而成。

[0035]优选地，还含有20ng/mL的抗CD3单抗。

[0036]优选地，还含有20ng/mL的抗CD28单抗。

[0037]一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的方法，正式培养前使用含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养基孵育24h。

[0038]优选地，具体步骤为：
[0039]步骤S1、TIL细胞分离
[0040]取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。

消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。

细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。

弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。

离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。

[0041]步骤S2、培养和扩增
[0042]当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗CD3单抗、抗CD28单抗和曼宋酮C或曼宋酮G的培养瓶内孵育，孵育24h后加入IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL。

[0043]优选地，步骤S1中IL-2的浓度为2000IU/mL。

[0044]优选地，抗CD3单抗浓度为20ng/mL。

[0045]优选地，抗CD28单抗浓度为20ng/mL。

[0046]优选地，曼宋酮C或曼宋酮G的浓度为20μg/mL。

[0047]优选地，步骤S2中IL-2的浓度为4000IU/mL。

[0048]一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞TIL的培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。

[0049]优选地，还含有20ng/mL的抗CD3单抗。

[0050]优选地，还含有20ng/mL的抗CD28单抗。

[0051]有益效果：
[0052]本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G，不仅可以显著促进TIL细胞的体外增殖，还可以显著提高TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以用于制备TIL细胞培养液。

附图说明
[0053]图1为呋喃天竺葵酮类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力；
[0054]图2为益智仁萜二醇类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力；
[0055]图3为曼宋酮类化合物孵育的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力。

具体实施方式
[0056]下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

[0057]实施例1：
[0058]一、实验材料
[0059]X-VIVO-15培养基购自Lonza公司；磷酸缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养基、CD3单抗、CD28单抗购自Gibco公司；人AB型血清由淮安市血液中心提供；IL-2购自北京四环生物制药公司；胶原酶IV型购自Sigma公司；淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋公司。

[0060]人肝癌细胞株HepG2为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、5％CO2培养箱内传代培养。

[0061]呋喃天竺葵酮A(CAS号：1143-45-9)、呋喃天竺葵酮B(CAS号：1143-46-0)、益智仁萜二醇A(CAS号：363610-30-4)、益智仁萜二醇B(CAS号：363610-32-6)、曼宋酮C(CAS号：5574-34-5)、曼宋酮F(CAS号：5090-88-0)、曼宋酮G(CAS号：7715-96-0)纯度不低于98％，化学结构式如下。

[0062]
[0063]二、实验方法
[0064]1、TIL细胞的分离
[0065]取肝癌患者手术切除的新鲜肝癌癌旁组织浸泡于PBS中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，PBS清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/mL的IV型胶原酶(Sigma-Aldrich)溶液中，37℃水浴消化2h。

消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用PBS冲洗组织块，收集滤液。

细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。

弃上清，加入PBS制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。

离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经PBS清洗后，按1×106/mL的浓度悬浮于含10％人AB型血清和IL-2(2000IU/mL)的X-VIVO-15培养基内，接种于12孔板上，3mL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，每3～5d换液一次。

[0066]2、实验分组
[0067]组别包括：呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C、曼宋酮F或曼宋酮G孵育组；不添加这些药物的对照组。

[0068]3、TIL细胞的培养和扩增方法
[0069]当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有20ng/mL的抗CD3单抗、20ng/mL 的抗CD28单抗和20μg/mL的呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C、曼宋酮F或曼宋酮G的培养瓶内孵育，孵育24h后加入4000IU/mL的IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度IL-2的新鲜X-VIVO-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的TIL并对各组TIL细胞进行计数。

[0070]4、对肿瘤细胞杀伤力检测
[0071]人肝癌细胞株HepG2为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、5％CO2培养箱内传代培养，取对数期进行后续实验。

[0072]取各组培养23d的TIL细胞作为效应细胞，以HepG2肝癌细胞为靶细胞，按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设单独靶细胞和单独效应细胞组，每组设3个复孔，放置37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，每孔加MTT(5mg/mL)10μL，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜150μL，振荡溶解10min后，用酶标仪570nm测吸光值A，按如下公式计算各组TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性。

[0073]杀伤率(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞A值)/单独靶细胞A值]×100％[0074]5、统计学处理
[0075]数据采用均值±标准偏差表示，用SPSS17.0统计软件行t检验，P<0.05具有统计学意义。

[0076]三、实验结果
[0077]1、各组TIL细胞的体外扩增
[0078]结果如表1所示。

培养23d时，呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G孵育组的TIL细胞总数显著高于对照组(P<0.05)，曼宋酮F 孵育组的TIL细胞总数与对照组的差异不明显(P＞0.05)。

[0079]表1各组TIL细胞总数
[0080]
[0081]可见，呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C 或曼宋酮G可以显著促进TIL细胞的体外增殖。

[0082]2、各组TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
[0083]培养23d时，呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G孵育组的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性显著优于对照组(P<0.05)，曼宋酮F孵育组的TIL细胞对肝癌细胞的杀伤活性与对照组的差异不明显(P＞0.05)。

[0084]结果如表2和图1-3所示。

[0085]表2各组TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
[0086]
[0087]可见，呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C 或曼宋酮G可以显著提高TIL细胞对肝癌细胞的杀伤力。

[0088]实施例2：
[0089]一种TIL细胞培养基，通过在X-VIVO-15培养基中添加20μg/mL的呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G配制而成。

在用于培养TIL细胞时，仅需要再添加适量抗CD3单抗和抗CD28单抗即可，使用便捷。

[0090]本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G，不仅可以显著促进TIL细胞的体外增殖，还可以显著提高TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

呋喃天竺葵酮A、呋喃天竺葵酮B、益智仁萜二醇A、益智仁萜二醇B、曼宋酮C或曼宋酮G可以用于制备TIL细胞培养液。

[0091]上述实施例旨在具体介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围局限于该具体实施例。

图1
图2
图3。