westernblot
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Tween是一种离子表面活性剂，它可加 速抗体非特异性结合的分离。
封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封 闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一 般采用异源性蛋白质，常用的有2%BSA，5% 脱脂牛奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应 考虑与检测试剂相适应，其次是尽可能使非特 异着色背景浅。
蛋白浓度测定：BCA法
测定原理：利用碱性溶液中的铜试剂与 供试样品中的蛋白质形成铜-蛋白质复合 物来还原磷钼酸-磷钨酸试剂，得到的反 应液为深蓝色的溶液。根据比色测得的 吸光值，即从标准曲线推算出样品中蛋 白质的含量。
BCA法操作步骤
配制蛋白标准 加样 ：标准蛋白、待检测样品 加显色工作液，混匀，孵育显色 酶标仪检测 作出标准曲线，计算浓度
Western Blot 技术简介
珠江医院神经外科实验室
概述
Western Blot 中文意思为蛋白质印迹， 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传 学中常用的一种实验方法。
Western Blot原理
通过电泳分离不同分子量大小的蛋白组 分，然后将凝胶上的蛋白转移至固相支 持物如(PVDF膜)上，再使用特异性抗体 作为探针，与蛋白质抗原发生免疫反应， 最后通过底物显色或放射自显影对靶蛋 白进行检测。
37℃封闭2h，也可在4℃过夜。
抗体杂交
主要采用间接法。即先加入未标记特异 性第一抗体（兔抗Neurocan）与膜上抗原 （Neurocan蛋白）结合，再加入标记的第二 抗体（羊抗兔- HRP ）进行杂交检测，标记 二抗的物质有放射性核素、酶、以及生 物素等。
一抗
１）膜放入杂交袋中，加入一抗，封口， 37℃孵育2h或4℃孵育过夜。
转膜注意事项
每层之间不能有气泡，可以用10ml吸管 轻轻在上一层滚动去除气泡。
面积大小的问题 叠放顺序不能弄错 盖子盖上后不再移动
Marker 的染色
剪下Marker 部分，丽春红室温染色10分 钟，流水冲洗，晾干保存 。
染膜：可用丽春红染色，不能用考马斯 亮蓝。
洗膜
PBS-T室温摇洗，10min ×3次，尽量洗 去转印膜上的SDS。
电泳中常出现的一些现象：
︶ 条带呈笑脸状：凝胶不均匀冷却，中 间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状：可能是由于装置不合 适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有 气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏 斜。 条带两边扩散：加样量过多。
考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝室温摇染45 min。 脱色液室温摇洗10 min×4次。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具 有良好的蛋白吸附、物理强度，以及具 有良好的化学兼容性。有两种规格： Immobilon-P（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa)。
半干式电转印
1. 蛋白电泳结束后，取出凝胶，在电转缓冲 液中漂洗数秒。
2. 将PVDF膜和滤纸剪为与凝胶一样大小， PVDF膜放入甲醇浸泡，使其活化，然后将膜 和滤纸放入转移缓冲液中湿润5-10min. 3. 按照由下到上为：滤纸3层、膜、凝胶、滤 纸3层的顺序放入电转槽中。 4. 盖上阴极电极板。
SDS-PAGE原理
在变性条件下（0.1%SDS）进行单向凝 胶电泳，蛋白在凝胶介质中向阳极泳动 时依分子量的大小不同而分离。
配胶
分离胶浓度：根据目的蛋白分子量大小， 选择不同浓度的分离胶。
浓缩胶：浓缩胶对蛋白有堆积作用，凝 胶浓度较小，孔径较大，蛋白样品经过 浓缩胶时，被浓缩成一个狭窄的区带。
配胶注意事项
分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空 间，否则起不到浓缩效果。
凝胶通常在半小时左右凝聚为好，过快表示 TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂， 而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用 量不够或者系统试剂不纯或失效。
混合搅拌速度：太快产生气泡影响聚合，导致 离后，必须从凝胶中转 移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合 蛋白又不影响蛋白质的抗原活性，而且支持物 本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物 有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程采用电转印法， 分为半干式和湿式转印两种模式。
PVDF膜
Western Blot 主要步骤
蛋白质的SDS-PAGE 转膜 抗原抗体结合反应 显色
SDS-PAGE
SDS：十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子 去污剂 ，加入到电泳系统中能使蛋白质 的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质 分子上，使各种蛋白质-SDS复合物都带 上相同密度的负电荷，其数量远远超过 了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖 了不同种类蛋白质原有的电荷差别。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
上样量： Marker、待测样品
边缘效应示意图
电泳：
加样完毕，选择适当的电压进行电泳， 上层浓缩胶的电泳电压不能太高，使样 品更好的进入凝胶，电泳采用恒压的模 式。一般浓缩胶80V，分离胶100V，电 泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处， 即停止电泳。
电泳速度的影响因素
蛋白质分子量大小 电压大小 分离胶浓度
电转三明治顺序
转膜电流
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/ 膜。
分离胶浓度和转膜时间
蛋白大小(kD) 80～140 25 ～ 80 15 ～ 40
<20
胶浓度 8% 10% 12% 15%
转移时间(h) 1.5-2.0 1.5 0.75 0.5
按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移 时间，具体可以根据实际适当调整。
标准曲线示意图
样品的准备（蛋白电泳）
将蛋白样品稀释（浓缩）到合适的浓度。 取适量蛋白样品，加入等体积的
2×loading buffer ，混匀。 100℃煮沸10分钟，冰浴。
Marker 的选择
预染、非预染 分子量高低
Marker示意图
加样：
加入蛋白Marker和待分析样品，注意加 样时间要尽量短，以免样品扩散，为避 免边缘效应，可在未加样的孔中加入等 量的样品缓冲液。
封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封 闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一 般采用异源性蛋白质，常用的有2%BSA，5% 脱脂牛奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应 考虑与检测试剂相适应，其次是尽可能使非特 异着色背景浅。
蛋白浓度测定：BCA法
测定原理：利用碱性溶液中的铜试剂与 供试样品中的蛋白质形成铜-蛋白质复合 物来还原磷钼酸-磷钨酸试剂，得到的反 应液为深蓝色的溶液。根据比色测得的 吸光值，即从标准曲线推算出样品中蛋 白质的含量。
BCA法操作步骤
配制蛋白标准 加样 ：标准蛋白、待检测样品 加显色工作液，混匀，孵育显色 酶标仪检测 作出标准曲线，计算浓度
Western Blot 技术简介
珠江医院神经外科实验室
概述
Western Blot 中文意思为蛋白质印迹， 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传 学中常用的一种实验方法。
Western Blot原理
通过电泳分离不同分子量大小的蛋白组 分，然后将凝胶上的蛋白转移至固相支 持物如(PVDF膜)上，再使用特异性抗体 作为探针，与蛋白质抗原发生免疫反应， 最后通过底物显色或放射自显影对靶蛋 白进行检测。
37℃封闭2h，也可在4℃过夜。
抗体杂交
主要采用间接法。即先加入未标记特异 性第一抗体（兔抗Neurocan）与膜上抗原 （Neurocan蛋白）结合，再加入标记的第二 抗体（羊抗兔- HRP ）进行杂交检测，标记 二抗的物质有放射性核素、酶、以及生 物素等。
一抗
１）膜放入杂交袋中，加入一抗，封口， 37℃孵育2h或4℃孵育过夜。
转膜注意事项
每层之间不能有气泡，可以用10ml吸管 轻轻在上一层滚动去除气泡。
面积大小的问题 叠放顺序不能弄错 盖子盖上后不再移动
Marker 的染色
剪下Marker 部分，丽春红室温染色10分 钟，流水冲洗，晾干保存 。
染膜：可用丽春红染色，不能用考马斯 亮蓝。
洗膜
PBS-T室温摇洗，10min ×3次，尽量洗 去转印膜上的SDS。
电泳中常出现的一些现象：
︶ 条带呈笑脸状：凝胶不均匀冷却，中 间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状：可能是由于装置不合 适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有 气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏 斜。 条带两边扩散：加样量过多。
考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝室温摇染45 min。 脱色液室温摇洗10 min×4次。
我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具 有良好的蛋白吸附、物理强度，以及具 有良好的化学兼容性。有两种规格： Immobilon-P（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa)。
半干式电转印
1. 蛋白电泳结束后，取出凝胶，在电转缓冲 液中漂洗数秒。
2. 将PVDF膜和滤纸剪为与凝胶一样大小， PVDF膜放入甲醇浸泡，使其活化，然后将膜 和滤纸放入转移缓冲液中湿润5-10min. 3. 按照由下到上为：滤纸3层、膜、凝胶、滤 纸3层的顺序放入电转槽中。 4. 盖上阴极电极板。
SDS-PAGE原理
在变性条件下（0.1%SDS）进行单向凝 胶电泳，蛋白在凝胶介质中向阳极泳动 时依分子量的大小不同而分离。
配胶
分离胶浓度：根据目的蛋白分子量大小， 选择不同浓度的分离胶。
浓缩胶：浓缩胶对蛋白有堆积作用，凝 胶浓度较小，孔径较大，蛋白样品经过 浓缩胶时，被浓缩成一个狭窄的区带。
配胶注意事项
分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空 间，否则起不到浓缩效果。
凝胶通常在半小时左右凝聚为好，过快表示 TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂， 而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用 量不够或者系统试剂不纯或失效。
混合搅拌速度：太快产生气泡影响聚合，导致 离后，必须从凝胶中转 移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合 蛋白又不影响蛋白质的抗原活性，而且支持物 本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物 有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程采用电转印法， 分为半干式和湿式转印两种模式。
PVDF膜
Western Blot 主要步骤
蛋白质的SDS-PAGE 转膜 抗原抗体结合反应 显色
SDS-PAGE
SDS：十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子 去污剂 ，加入到电泳系统中能使蛋白质 的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质 分子上，使各种蛋白质-SDS复合物都带 上相同密度的负电荷，其数量远远超过 了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖 了不同种类蛋白质原有的电荷差别。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
上样量： Marker、待测样品
边缘效应示意图
电泳：
加样完毕，选择适当的电压进行电泳， 上层浓缩胶的电泳电压不能太高，使样 品更好的进入凝胶，电泳采用恒压的模 式。一般浓缩胶80V，分离胶100V，电 泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处， 即停止电泳。
电泳速度的影响因素
蛋白质分子量大小 电压大小 分离胶浓度
电转三明治顺序
转膜电流
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/ 膜。
分离胶浓度和转膜时间
蛋白大小(kD) 80～140 25 ～ 80 15 ～ 40
<20
胶浓度 8% 10% 12% 15%
转移时间(h) 1.5-2.0 1.5 0.75 0.5
按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移 时间，具体可以根据实际适当调整。
标准曲线示意图
样品的准备（蛋白电泳）
将蛋白样品稀释（浓缩）到合适的浓度。 取适量蛋白样品，加入等体积的
2×loading buffer ，混匀。 100℃煮沸10分钟，冰浴。
Marker 的选择
预染、非预染 分子量高低
Marker示意图
加样：
加入蛋白Marker和待分析样品，注意加 样时间要尽量短，以免样品扩散，为避 免边缘效应，可在未加样的孔中加入等 量的样品缓冲液。