乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008， 34（3）： 418-422http：///zwxb/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9E-mail： xbzw@
DOI： 10.3724/SP.J.1006.2008.00418
乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系
王爱勤1，2，3范业赓2赵晓艳2何龙飞2杨丽涛2，3李杨瑞1，2，3，*
（1广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室， 广西南宁 530007； 2广西大学农学院， 广西南宁 530005； 3中国农业科学院甘蔗研
究中心， 广西南宁 530007）
摘要： ACC合酶（ACS）是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。

为明确ACS基因在甘蔗茎中的表达与乙烯释放量、蔗糖积累的关系， 在克隆到甘蔗ACS基因3个成员（Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3）的基础上， 分别以它们作为
探针， Northern杂交检验其在茎中的时空表达。

结果表明， 甘蔗生长后期， ACS基因3个成员在茎中不同品种和节间
持续表达， Sc-ACS1和Sc-ACS2表达维持较低水平， Sc-ACS3维持较高水平。

乙烯利处理明显提高3个基因在茎的未
成熟和正在成熟节间的表达， 且Sc-ACS1和Sc-ACS2在未成熟节间的表达持续时间长达一个月， 而Sc-ACS3在未成
熟节间的较高水平表达可持续45 d。

该结果与甘蔗节间尤其是未成熟和正在成熟节间的乙烯释放量增加以及糖分积
累的效应基本一致。

相关分析表明， 桂糖17品种乙烯释放量与蔗糖分在处理后14 d和28 d分别极显著和显著负相关， 但巴西固氮品种B1未达显著水平。

关键词：甘蔗； ACC合酶； 表达； 乙烯释放量； 糖分积累
Expressions of Three Members of ACS Gene Family Induced by Ethephon Relationship of Ethylene Production and Sugar Accumulation in Sugar-cane Stalks
W ANG Ai-Qin1， 2， 3， FAN Ye-Geng2， ZHAO Xiao-Yan 2， HE Long-Fei 2， Y ANG Li-Tao2， 3， and LI Yang-Rui 1， 2， 3， *
（1 Key Laboratory of Guangxi Crops Genetic Improvement & Biotechnology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi； 2 Agricultural College， Guangxi University， Nanning 530005， Guangxi； 3 Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China）
Abstract： 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase （ACS） is one of the key rate-limiting enzymes for ethylene biosyn-thesis in higher plants. In order to study expressions of ACS genes in stalks regulated with ethephon and its correlation with eth-ylene production and sucrose accumulation in sugarcane， the spatial and temporal expressions of the three genes were tested in the stalks of sugarcane with Sc-ACS1， Sc-ACS2， and Sc-ACS3 as the probes， respectively， based on the cloning of Sc-ACS1， Sc-ACS2， and Sc-ACS3 of ACS gene family. Northern blotting analysis showed that three members of ACS gene family kept expressions during late growth stage in the varieties and internodes with a lower level except Sc-ACS3. Ethephon treatment in-creased expressions of the three genes in the immature and maturing internodes. Sc-ACS1 and Sc-ACS2 maintained the highest expression level for 30 d and returned to normal level later， however， Sc-ACS3 kept the highest level for 45 d in the immature stalks. The ethephon-induced gene expressions were in accordance with the significant effects on ethylene production and sucrose accumulation in the immature and maturing internodes. The ethylene production was correlated negatively with the sucrose ac-cumulation in internodes of variety GT17 significantly at P≤0.01 and P≤0.05 at 14 d and 28 d after treatment with ethephon， respectively， but not significantly in the variety B1.
Keywords：Saccharum officinarum L.； 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase； Expression； Ethylene production； Su-crose accumulation
基金项目：广西青年科学基金项目（桂科青0640003）； 广西农业科学院博士后基金项目（桂财教函[2005]205号）
作者简介：王爱勤（1966-）， 女， 副教授， 博士， 主要从事植物生理与分子生物学研究。

*通讯作者（Corresponding author）：李杨瑞。

E-mail： liyr@
Received（收稿日期）： 2007-05-18； Accepted（接受日期）： 2007-09-16.
第3期王爱勤等： 乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族3成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系419
乙烯不仅影响果实成熟、衰老和休眠， 而且还调控植物的许多发育过程， 比如种子萌发、根的发生、植株生长发育、花芽分化、性别分化以及对环境胁迫的反应等。

生理生化研究表明， 乙烯对甘蔗的生长和糖分积累具有重要的调控作用[1-3]。

Solomon等[2]报道， 冬季甘蔗收获前7～10 d， 用乙烯利处理甘蔗， 不仅提高甘蔗的品质， 而且有效提高甘蔗地下潜伏芽的发芽率。

Li和Solomon[3]等报道， 高浓度乙烯利（200～400 mg L-1） 明显抑制甘蔗生长， 但低浓度（80～100 mg L-1） 则显著促进甘蔗生长。

在机理研究方面， 以其他植物或果实进行的试验中， 许多研究者认为外源乙烯的作用是通过诱导内源乙烯形成及信号传导调控目的基因的表达实现的[4-7]。

但Foster等[8]认为外源乙烯处理并不影响ACC和ACC结合物的水平， 因而不会改变内源乙烯的生物合成。

Yao等[1]报道乙烯利对甘蔗的催熟效应体现在显著提高未成熟节间的糖分， 但对成熟甘蔗或成熟节间的影响不大。

然而， 迄今仍缺乏在分子水平的研究证据。

在高等植物体内， 乙烯的生物合成途径已经明确， ACC合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）是其关键酶， 从许多植物的各种组织中已克隆到编码这两个关键酶的基因， 它们的表达和活性大小直接影响乙烯的生物合成和产量。

我们已经分离到编码甘蔗ACC合酶（ACS）的3个基因家族成员（基因注册号分别为AY620985、AY620986和AY788919） 并检测它们在生长前期根、叶中的表达[9-10]， 此文拟从分子水平探讨甘蔗生长后期， 乙烯利诱导甘蔗ACS基因在茎的不同节间表达与乙烯释放量和糖分积累的关系。

1材料和方法
1.1供试材料及乙烯利处理
甘蔗品种（Saccharum officinarum L. Hybrid）桂糖17 （GT17）和巴西固氮品种B1由广西大学甘蔗研究所提供。

2005年4月上旬在广西大学农学院教学科研基地种植， 按照甘蔗大田生产方式栽培和管理。

在10月23日用400 mg L-1乙烯利进行叶面喷施， 以喷施自来水作为对照， 于喷后3、7、14、21、26、30、45和56 d分别采样， 每次6株， 分别取茎尖到+3节间为未成熟节间（上段）， +6到+11节间为正在成熟的节间（中段）， +22到+28节间为已成熟节间（下段）， 进行乙烯释放量、蔗糖分含量测定和RNA提取。

1.2 乙烯释放量的测定
采用岛津GA-17A气相色谱仪， 其色谱柱为GDX-101不锈钢柱， 载气N2流速为50 mL min-1， H2流速为50 mL min-1， 空气流速为500 mL min-1。

FID检测器柱温80，
℃汽化室温度110，
℃检测器温度150℃。

1.3甘蔗糖分的测定
用常规方法[11]。

1.4总RNA的提取
用家用多功能食品加工机（DEPC处理）将茎捣碎成匀浆， 取匀浆的渣汁混合物2 mL（即1/5体积的离心管）， 加入10 mL离心管（DEPC处理）， 迅速加入6 mL 异硫氰酸胍提取液（4 mol L-1的异硫氰酸胍； NaAc， pH 4.2）， -80℃抽提30 min后于-20 12
℃ 000×g离心20 min； 取上清液用125∶24∶1的酸性苯酚、氯仿、异戊醇抽提3次， 再以异丙醇沉淀总RNA， 70%乙醇洗涤沉淀3次， 去掉盐分， 用适量DEPC处理过的ddH2O 溶解RNA， 紫外分光光度法检测总RNA纯度， 1%琼脂糖凝胶电泳检验RNA样品的完整性。

1.5Northern杂交
7 μg样品总RNA经1.2%甲醛变性胶电泳后， 将RNA转移到尼龙膜上； 采用的Hybond-N+膜是由Amersham公司提供。

杂交膜的预杂交、杂交和洗膜等方法均参考Wang等[12]文献。

杂交膜于80℃下烘干2 h以固定RNA。

分别以Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3 DNA为探针， 根据Promega公司提供的Random Labeling Systems反应盒用32P同位素标记DNA， 标记反应在50 μL的体积进行。

用北京博大泰克高效液相杂交液， 杂交膜在65℃杂交过夜。

2×SSC， 0.1% SDS洗液65℃洗膜2次， 每次20 min， 再用0.1×SSC、0.1%SDS的洗液洗膜2次， 每次20 min。

所得的膜用保鲜膜包好， 放置在加有增感屏的压片夹内， 将一张磷屏放置在压片夹内的保鲜袋上， 夹紧并将盒子盖紧， 室温放置过夜， 然后取出磷屏， 用台风9410-TYPHOON型Variable Mode Imager扫描仪扫描并保存图像。

2结果与分析
2.1乙烯利处理对甘蔗不同节段乙烯释放量的影响
SAS软件统计分析表明， 2个甘蔗品种对照的乙烯释放量在后期均维持在较低水平， 2个品种的乙烯释放量除未成熟节间、处理后3 d的正在成熟和已经成熟的节间有显著差异外， 其余都不显著， 乙烯释放量以未成熟节间高于正在成熟和已经成熟的节间。

与清水处理相比， 乙烯利处理后3～14 d极显著地提高2个品种各节间的乙烯释放量。

处理后7 d乙烯释放量都达到最大值， 但乙烯利诱导乙烯产生的效果因品种和节间不同而异（图1）。

乙烯利处理后3 d， B1品种各个节间乙烯释放量高于GT17； 处理后7 d， B1品种未成熟和已经成熟的节间乙烯释放量仍高于
420作物学报第34卷
GT17（图1-B）， 但正在成熟节间及处理后14 d未成熟节间和正在成熟节间， 乙烯释放量小于GT17（图1-A 和B）。

乙烯利处理后3～14 d， B1品种的乙烯释放量表现为未成熟节间＞正在成熟节间＞已经成熟的节间＞对照各相应节间。

GT17品种除处理后7 d的乙烯释放量表现为正在成熟节间＞未成熟节间＞已经成熟的节间＞对照各相应节间外， 其余与B1品种相同。

乙烯利处理后21 d和28 d， B1品种不同节间乙烯释放量与对照差异不显著（图1-B）， 但GT17品种的已成熟节间在处理后21 d和未成熟节间在处理后28 d （图1-A）都高于对照， 并达到显著水平。

图1乙烯利对甘蔗GT17（A）和B1（B）品种不同节间乙烯
释放量的影响
Fig. 1 Effect of ethephon on ethylene production in different internodes of sugarcane varieties GT17 （A） and B1 （B） （U）CK、（M）CK 和 （D）CK分别为两个品种未成熟、正在成熟和已经成熟的节间对照； 而（U）400、（M）400 和 （D）400 分别为它们的处理。

标有相同字母者为新复极差测验不显著。

以下相同。

（U）CK， （M） CK， and （D） CK were the controls of immature， ma-turing and matured internodes， respectively， and （U） 400， （M） 400，and （D） 400 were the corresponding treatments with ethephon， respectively. Bars superscripted by the same letter are not signifi-cant by different as determined by Duncan’s test （P≤0.001） 2.2乙烯利处理对不同品种甘蔗蔗糖分的影响
由图2可以看出， 对照的两个品种未成熟节间的蔗糖分始终低于正在成熟和已成熟节间， B1品种未成熟节间的蔗糖分在处理后14～56 d保持一定水平， GT17品种则在处理后28 d达到最高， 然后也稳定在一定水平； 两品种正在成熟节间和已经成熟节间的蔗糖分， 在处理后28 d都达到最高， 处理后56 d还稳定在高蔗糖分水平。

用SAS软件统计分析表明， 两品种未成熟节间蔗糖分与正在成熟和已成熟节间差异显著， 而成熟节间之间差异不显著。

在处理后14～56 d， B1品种未成熟节间蔗糖分差异不显著， 而GT17品种14～28 d差异显著， 28～56 d差异不显著； 正在成熟和已经成熟节间， 两品种除B1已成熟节间在14～28 d差异显著外， 其余差异不显著。

整个生长后期， 两品种蔗糖含量除GT17在处理后28 d表现为已成熟节间＞正在成熟节间＞未成熟节间外， 均表现为正在成熟节间＞已成熟节间＞未成熟节间。

图2乙烯利处理对甘蔗GT17 （A） 和B1 （B）品种不同节间蔗
糖含量的影响
Fig. 2 Effect of ethephon on sucrose accumulation in different internodes of sugarcane varieties GT17 （A） and B1 （B）
乙烯利处理对甘蔗糖分的影响因品种和节间不同而不同。

在处理后14 d和28 d， B1茎未成熟节间、正在成熟节间和已成熟节间乙烯利处理的蔗糖分都显著高于对照的， 催熟和增糖效应明显； 但处理后56 d， 尽管蔗糖含量与对照没有显著差异， 但都比28 d有所下降（图2-B）。

对GT17， 乙烯利处理14 d和28 d各节间蔗糖分均低于对照， 但差异不显著； 在处理28 d后， 已成熟节间蔗糖分迅速提高， 接近对照水平； 处理56 d后， 未成熟节间蔗糖含量明显比对照高， 正在成熟节间的接近于对照的， 但与对照的差异不显著， 而已成熟节间的比对照的低， 差异显著（图2）， 催熟和增糖效应明显滞后（图2-A）。

2.3不同品种甘蔗节间乙烯释放量和糖分积累相关性分析
相关性分析表明， B1品种各节间在乙烯利处理后14 d和28 d， 乙烯释放量和蔗糖分相关系数分别为r1=0.085和r2=0.361， 均没有达到显著水平（r0.05
第3期王爱勤等： 乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族3成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系421
=0.576）； 而GT17品种在乙烯利处理后14 d和28 d， 乙烯释放量和蔗糖分相关系数分别为r3= -0.845和r4= -0.646分别达到极显著和显著水平（r0.01 = 0.708， r0.05 = 0.576）， 呈负相关关系。

2.4甘蔗ACS基因3成员在茎中的表达
Northern杂交分析表明， 在甘蔗生长后期， 高浓度乙烯利处理后14 d， 两品种各节间的清水对照， 与Sc-ACS3比， 甘蔗Sc-ACS1和Sc-ACS2都维持在一个比较低的水平（图3）。

Sc-ACS1和Sc-ACS2基因在品种间的表达也不同， Sc-ACS1在B1品种中的表达高于在GT17品种中， Sc-ACS2则刚好相反， 在GT17品种中表达高于B1品种。

400 mg L-1乙烯利处理14 d后， 用甘蔗ACS基因3成员分别作为探针， 在B1品种的3个节间， 都检测到比对照更强的杂交信号， 尤其是未成熟节间和正在成熟节间； 但GT17品种除了未成熟节间和正在成熟节间有稍强的信号外， 与对照信号相当。

Sc-ACS3在整个生长后期处理和对照都表现出极强的表达信号。

图3甘蔗ACS基因3成员在甘蔗两品种不同节间的表达Fig. 3 Expressions of three members of ACC synthase gene family in two sugarcane varieties and all the internodes at 14 d after treatment with ethephon at late growth stage
泳道1～3分别为巴西固氮品种B1的未成熟、正在成熟和已成熟节间对照， 4～6分别为乙烯利400 mg L-1处理； 7～9分别为广西桂糖17品种的未成熟、正在成熟和已成熟节间对照， 10～12分别为
乙烯利400 mg L-1处理。

Lanes 1-3 show the expressions of three genes in immature， ma-turing and matured internodes in the control of B1 and lanes 4-6 are those of the ethephon treatment， respectively. Lanes 7-9 show that in the control of GT17， and lanes 10-12 show the ethephon treat-
ment， respectively.
2.5甘蔗ACS基因3成员在未成熟节间的持续表达
Northern杂交表明， 甘蔗生长后期B1品种对照的未成熟节间， ACS基因3成员表达持续时间都较长， Sc-ACS1 和 Sc-ACS3 基因在处理后14～45 d， 持续表达的信号都比Sc-ACS2强。

乙烯利处理明显提高3成员尤其是Sc-ACS1和Sc-ACS3的表达。

Sc-ACS1和Sc-ACS2基因持续30 d后， 表达信号强度降到对照水平， 而Sc-ACS3基因则持续45 d后， 仍保持极强的表达信号（图4）。

图4乙烯利对甘蔗ACS基因3成员在未成熟节间持续表达的影响Fig. 4 Expressions of three genes in the immature internodes of the variety B1 at different time after treatment with ethephon
at late growth stage
泳道“-”为空白对照， C14d-C45d分别为B1品种在处理后14、 21、30 和 45 d， 未成熟节间对照， E14d-E45d分别为乙烯利处理。

Lanes labeled with “-” are the blank （control）， and lanes labeled with C14d-C45d are the control of the variety B1 and lanes labeled with E14d-E45d are the treatment with ethephon at 14， 21， 30，and
45 d， respectively.
3讨论
乙烯利作为甘蔗催熟剂的效果早已得到证明。

姚瑞亮等[7]研究表明， 乙烯利能显著提高未成熟节间的蔗糖分， 在施用后2周即表现明显的效应， 4～6周达高峰， 以后效应虽有所降低， 但仍然持续相当长的时间， 对代谢活动缓慢或停滞的部位如成熟节间的蔗糖分积累没有影响， 不起催熟作用， 因此认为乙烯利催熟效应是在植株继续生长的条件下通过调控其代谢活动向有利于蔗糖分累积的方向发展而实现的， 其作用的主要部位是代谢活跃的部位， 代谢越活跃的部位乙烯利的催熟增糖效应越强[1，3]。

但潘有强等[18]研究表明， 甘蔗分蘖期用200 mg L-1浓度乙烯利处理， 甘蔗叶片生长首先受到抑制， 而且抑制效应持续100 d才能恢复到正常生长水平， 认为这是分蘖期高浓度乙烯利处理导致甘蔗产量下降的主要原因。

本研究结果与姚瑞亮等[1，3]的结果基本一致， 乙烯利能有效提高甘蔗茎节乙烯释放量， 表现为未成熟节间＞正在成熟节间＞成熟节间， 能显著提高未成熟节间糖分积累速度， 但催熟增糖效率与不同品种和部位有关。

其催熟增糖滞后与ACS基因3成员在两个甘蔗品种茎的时空表达有关， ACS基因表达与甘蔗茎节乙烯释放量呈正相关， 甘蔗茎节乙烯释放量与蔗糖分含量呈负相关。

近年来糖信号与激素信号的通讯研究表明， 高浓度蔗糖通过提高ABA水平抑制拟南芥幼苗发育， 而乙烯通过降低ABA水平或敏感性拮抗ABA， 从而拮抗了幼苗发育的葡萄糖阻遏， 使幼苗发育的基因得到表达， 促进幼苗发育 [13-14]。

植物对非生物胁迫的乙烯反应与不同植物和组织对乙烯的感受能力有
422作物学报第34卷
关， 由乙烯受体表达水平调控。

乙烯反应与受体表达水平的关系可能和乙烯产量有关， 如果由于乙烯合成增加导致乙烯反应增强， 可能会诱导受体表达水平提高， 植物乙烯敏感性降低[10]。

在某些胁迫条件下， 如果乙烯反应增强并不伴随乙烯产量上升， 则增强的乙烯反应可能通过乙烯受体的减少而实现[16-17]。

我们以前的研究表明， 乙烯利处理2 h在叶中检测到的Sc-ACS1表达明显高于对照的， 处理10 h检测到的Sc-ACS2 基因表达明显高于对照和处理2 h 的， 而处理2～10 h在根中检测到的Sc-ACS3 基因具与对照一样的表达信号。

本研究表明， 甘蔗生长后期， 处理后14 d在甘蔗茎的各个节间都检测到ACS基因3成员的表达信号， 高浓度乙烯利处理提高了3成员在甘蔗茎各节间的表达， 表达量为未成熟节间＞正在成熟节间＞成熟节间； Sc-ACS3表达量大于Sc-ACS1和Sc-ACS2， 并持续较长的时间。

推测乙烯利在甘蔗生长后期的作用， 可能是先后诱导叶片Sc-ACS1和Sc-ACS2基因表达， 促进叶片内源乙烯的产生， 进而依次诱导ACS 基因家族3个成员在未成熟和正在成熟节间及Sc-ACS3在根中的时空表达， 从而加速这些器官乙烯的形成， 使其释放量增加。

可能不同品种和部位对乙烯的感受能力即敏感性不同， 因而调控甘蔗茎中内源激素和相关酶的平衡能力也不同， 协同调控甘蔗生长、蔗糖分运输和积累的能力也不同[1， 18-19]。

高浓度乙烯可能降低顶芽和休眠芽的ABA水平或敏感性拮抗ABA， 从而打破休眠芽的休眠， 在有利于生长的环境条件下促进分蘖和顶端生长[1-3]， 以形成新的代谢库， 上茎段继续生长， 形成叶片光合产物的新库， 茎糖分积累的新源； 而中、下茎段累积的蔗糖分被分蘖和蔗株生长所消耗， 引起甘蔗成熟节间蔗糖分的下降[2-3， 20]。

4结论
甘蔗生长后期， 高浓度乙烯利处理提高了ACS 基因3成员在甘蔗茎各节间的表达， 表现为未成熟节间＞正在成熟节间＞成熟节间； Sc-ACS3表达量大于Sc-ACS1和Sc-ACS2， 并持续较长的时间。

3成员在茎中的表达与其乙烯释放量增加和糖分积累一致。

乙烯释放量与蔗糖分积累的相关性因品种而异。

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