基因工程实验三、质粒的制备及目的基因的扩增
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实验三 质粒的制备及目的基 因的扩增 岳续朋
生物工程教研室
第一部分：质粒的提取 实验目的：
1、了解质粒DNA提取的方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及方法； 3、熟悉常用试剂的配制方法。
实验原理：
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的 小环状DNA分子。大多数质粒都是双链的共价闭合环状 DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)分 子 ，天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基 对都有。
第6轮扩增
PCR反应的五要素：
PCR反应的五要素：
1、引物（primer）
2、酶（Taq DNA polymerase）
3、dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
4、模板 （template）
5、Mg2+ （magnesium）
PCR原理
PCR反应的条件：
94℃，5min 94℃，40s 60℃，40s 72℃，1min 72℃，5min 12℃，∞
二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液
中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:
Solution I: 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl ， pH=8.0；Tris-HCl的作用是提供合适的pH值，EDTA的作用是抑制DNA 酶的活性，葡萄糖的作用是悬浮； Solution II: 0.2Ml NaOH / 1% SDS；作用是使细胞裂解；（都要 新鲜配制） Solution III: 3Ml 醋酸钾 / 2Ml 醋酸；作用：SDS与醋酸钾形成 十二烷基硫酸钾（PDS,沉淀），而蛋白容易和SDS结合，所以蛋白被 沉淀下来，而长长的基因组DNA也被沉淀下来。
第1轮结束 第2轮开始
PCR反应条件
PCR的基本原理
Taq
Taq
72℃ 50℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
Taq
Taq
PCR反应条件
PCR的基本原理
72℃
PCR过程 PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
PCR的基本原理
第3轮扩增
PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件
第1轮扩增 第2轮扩增
第4轮扩增 第5轮扩增
细菌裂解
细胞的裂解方法很多，如去污剂法、沸水热裂
法、碱变性法、有机溶剂法和溶菌酶法等。不
同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主
菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后 加以选择
碱裂解法(Alkaline )
[ 原理 ] 细菌悬浮液暴露于高 pH 的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁 破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十
Sense primer 3’ 5’
→
5’
Antisense primer
←
3 ’
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的 最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性，太短也会降低特异性。 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异性的扩增条带
PCR原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短
时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下 解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与 模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物 结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补 的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“ 半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 。(Plateau)。
PCR原理
PCR原理
95℃
模板DNA
PCR反应条件
PCR的基本原理
50℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR反应条件
PCR的基本原理
Taq酶
50℃ 72℃
PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR反应条件
PCR的基本原理
72℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
质粒抽提试剂盒的使用
质粒抽提试剂盒的使用
注意事项：
1、如果是手提质粒，溶液2一定要现配现用； 2、加溶液1时，一定要将菌块完全悬浮，不能有团块，否 则会影响细菌的裂解；
3、加溶液2和3时，不能剧烈震荡，以免使基因组DNA断
裂，不能完全被沉淀下来；
第二部分：目的基因的扩增
目的： 1、了解引物设计的原理； 2、掌握PCR技术的原理及操作。35个循环ຫໍສະໝຸດ PCR反应的体系（25ul）：
1、引物1：
2、引物2： 3、模板（提取的质粒）： 4、2x PCR master： 5、ddH2O：
1ul
1ul 1ul 12.5ul 9.5ul
引物设计的原则
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列 。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护 碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研 究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 ⑦避免引物形成发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
是一小段单链DNA 或RNA，作为DNA 复制的起始点，在核酸合成反 应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链 ，引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核 苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
生物工程教研室
第一部分：质粒的提取 实验目的：
1、了解质粒DNA提取的方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及方法； 3、熟悉常用试剂的配制方法。
实验原理：
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的 小环状DNA分子。大多数质粒都是双链的共价闭合环状 DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)分 子 ，天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基 对都有。
第6轮扩增
PCR反应的五要素：
PCR反应的五要素：
1、引物（primer）
2、酶（Taq DNA polymerase）
3、dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
4、模板 （template）
5、Mg2+ （magnesium）
PCR原理
PCR反应的条件：
94℃，5min 94℃，40s 60℃，40s 72℃，1min 72℃，5min 12℃，∞
二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液
中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:
Solution I: 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl ， pH=8.0；Tris-HCl的作用是提供合适的pH值，EDTA的作用是抑制DNA 酶的活性，葡萄糖的作用是悬浮； Solution II: 0.2Ml NaOH / 1% SDS；作用是使细胞裂解；（都要 新鲜配制） Solution III: 3Ml 醋酸钾 / 2Ml 醋酸；作用：SDS与醋酸钾形成 十二烷基硫酸钾（PDS,沉淀），而蛋白容易和SDS结合，所以蛋白被 沉淀下来，而长长的基因组DNA也被沉淀下来。
第1轮结束 第2轮开始
PCR反应条件
PCR的基本原理
Taq
Taq
72℃ 50℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
Taq
Taq
PCR反应条件
PCR的基本原理
72℃
PCR过程 PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
PCR的基本原理
第3轮扩增
PCR过程 PCR的特点 PCR反应条件
第1轮扩增 第2轮扩增
第4轮扩增 第5轮扩增
细菌裂解
细胞的裂解方法很多，如去污剂法、沸水热裂
法、碱变性法、有机溶剂法和溶菌酶法等。不
同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主
菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后 加以选择
碱裂解法(Alkaline )
[ 原理 ] 细菌悬浮液暴露于高 pH 的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁 破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十
Sense primer 3’ 5’
→
5’
Antisense primer
←
3 ’
引物设计的原则
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的 最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性，太短也会降低特异性。 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异性的扩增条带
PCR原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短
时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下 解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与 模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物 结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补 的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“ 半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 。(Plateau)。
PCR原理
PCR原理
95℃
模板DNA
PCR反应条件
PCR的基本原理
50℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR反应条件
PCR的基本原理
Taq酶
50℃ 72℃
PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR反应条件
PCR的基本原理
72℃ 95℃
PCR过程 PCR的特点
质粒抽提试剂盒的使用
质粒抽提试剂盒的使用
注意事项：
1、如果是手提质粒，溶液2一定要现配现用； 2、加溶液1时，一定要将菌块完全悬浮，不能有团块，否 则会影响细菌的裂解；
3、加溶液2和3时，不能剧烈震荡，以免使基因组DNA断
裂，不能完全被沉淀下来；
第二部分：目的基因的扩增
目的： 1、了解引物设计的原理； 2、掌握PCR技术的原理及操作。35个循环ຫໍສະໝຸດ PCR反应的体系（25ul）：
1、引物1：
2、引物2： 3、模板（提取的质粒）： 4、2x PCR master： 5、ddH2O：
1ul
1ul 1ul 12.5ul 9.5ul
引物设计的原则
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列 。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护 碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研 究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 ⑦避免引物形成发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
是一小段单链DNA 或RNA，作为DNA 复制的起始点，在核酸合成反 应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链 ，引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核 苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增