课题3 血红蛋白的提取和分离(学案)

虾对市爱抚阳光实验学校蛋白质的提取和别离
思考1：别离生物大分子的根本思路是什么？
选用一的物理或化学的方法别离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

思考2：蛋白质的别离和提取的原理是什么？
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力，可以用来别离不同蛋白质。

思考3：高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？
变性、变性、空间结构
思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白
一、根底知识：
㈠凝色谱法〔分配色谱法〕：
1、概念：根据被别离蛋白质的〔〕，利用具有状结构的凝的分子筛作用，来别离蛋白质的有效方法。

2、原理：当不同的蛋白质通过凝时，相对〔〕的蛋白质容易进入凝内部的通道，路程〔〕，移动速度
〔〕，而〔〕的蛋白质无法进入凝内部的通道，只能在〔〕移动，路程〔〕，移动速度〔〕，相对分子质量不同的蛋白质因此得以别离。

3、具体过程：
A. 的蛋白质由于
作用进入凝颗粒
内部而被滞留；
的蛋白质被排阻
在凝颗粒外面，在了里之间迅速通过。

B.〔1〕混合物上柱；
〔2〕洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝颗粒之外；
〔3〕的蛋白质被滞留；的蛋白质被
向下移动。

〔4〕不同的蛋白质分子完全分开；
〔5〕的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来，
的蛋白质还在行进中。

㈡缓冲溶液：
1、概念：在一的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液
PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵抗〔〕的对溶液的
〔〕的影响，维持PH根本不变。

3、缓冲溶液的配制
粒
B
A
多
孔
板
通常由〔 〕种缓冲剂溶解于水中配制而成。

调节缓冲剂的〔 〕就可以制得〔 〕使用的缓冲液。

思考：说出人体血液中缓冲对？
思考：在血红蛋白整个室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH 环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察〔〕和材料的研究〔活性〕 ㈢电泳：
1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2、原理：许多重要的生物大分子，如〔 〕都具有( ) 在( )下，这些基团会带上〔 〕 。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其〔 〕 移动。

电泳利用了待别离样品中各种分子
〔 〕以及分子本身〔 〕、
〔 〕的不同使带电分子产生不同的〔 〕，从而实现样品中各种分子的别离。

3、分类：
琼脂糖凝电泳
聚丙稀酰胺凝电泳。

测〔 蛋白质相对分子质量 〕通常用十二烷基硫酸钠〔SDS 〕—聚丙稀酰胺凝电
泳
蛋白质在聚丙烯酰胺凝中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝中参加( )。

SDS 能使蛋白质发生完全变性。

由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测的结果只是( )。

SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS 复合物，SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。

因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于( )。

二 操作
蛋白质的提取和别离一般分为四步：样品处理——粗别离——纯化——纯度鉴
1.样品处理
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除〔 〕
②方法：〔 〕离心〔速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀达不到别离的效果〕，然后用头吸管吸出上层透明的〔 〕，将下层〔 〕的红细胞液体倒入〔 〕 再参加用〔 〕的〔 〕质量分数为0.9％的氯化钠
溶液洗涤
⑤低速离心〔低速短时间〕
⑥重复4、5步骤〔 〕次，直至上清液中已没有〔 〕，说明洗涤干净。

利于后续血红蛋白的别离纯化，不可洗涤次数过少。

阴
极
带电性质、分子大小和形状的
分子向阳极移动
缓冲液
溶液槽
凝电泳原理示意图
(2)血红蛋白的释放
加〔〕到〔〕体积，再加40％体积的〔〕〔溶解细胞膜〕，置于〔〕上充分搅拌10分钟〔加速细胞破裂〕, 细胞破裂释放出血红蛋白.
(3)别离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:
第1层〔最上层〕：〔〕甲苯层
第2层〔中上层〕：〔〕的沉淀层，〔〕色薄层固体
第3层〔中下层〕：〔〕的水溶液层，〔〕的液体
第4层〔最下层〕：其它杂质〔〕的沉淀层
(4)透析
2.凝色谱制作
1〕凝色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙，再用100目尼龙纱包好。

a、选择适宜的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的〔〕，在0.5ml的〔〕头部切下〔〕长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙小圆片覆盖在〔〕上，用〔〕的尼龙纱将橡皮塞〔〕包好，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做〔〕，连接一细的〔〕，并用螺旋夹控制尼龙管的〔〕，另一端放入收集〔〕的收集器内③顶塞的制作：
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：将上述三者按相位置组装成一个整体。

⑤安装其他结构。

2〕凝色谱柱填料的处理
〔1〕凝的选择：〔〕。

〔2〕方法：
配置凝悬浮液：计算并称取一量的凝浸泡于〔〕中充分溶胀后，配成〔〕。

〔3〕凝色谱柱的装填方法
①固：将色谱柱处置固在支架上
②装填：将〔〕一次性的缓慢倒入〔〕内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝填装均匀。

③洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液〔pH为7.0〕充分〔〕12小时。

3〕样品参加与洗脱
〔1〕加样前：翻开下端出口，使柱内凝面上的〔〕缓慢下降到与〔〕平齐，关闭出口
〔2〕加透析样品
①调整缓冲液面：与凝面平齐
②滴加透析样品：用〔〕将1ml〔〕的样品加到色谱柱的〔〕
③样品渗入凝床：〔〕
④洗脱：翻开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集：待〔〕接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每〔〕收集一试管连续收集
思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的别离有什么意义？
血红蛋白是蛋白，因此在凝色谱别离时可以通过观察颜色来判断什么时候该收集洗脱液。

这使血红蛋白的别离过程非常直观，大大简化了操作。

思考：你能描述血红蛋白别离的完整过程吗？
血红蛋白提取和别离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗别离、纯化和纯度鉴。

首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即
〔〕；然后通过凝色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的〔〕；最后经聚丙烯酰胺凝电泳进行〔〕。

3.SDS－聚丙烯酰胺凝电泳
判断〔〕的蛋白质是否到达要求，需要进行蛋白质纯度的鉴。

SDS—聚丙烯酰胺凝电泳鉴血红蛋白纯度
电泳方法步骤1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2〕SDS—聚丙烯酰胺凝制备3〕样品处理： 4〕把凝固于电泳装置上
5)加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。

样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝色谱别离之前)的样品和凝色谱别离之后的样品
6)电泳 7〕剥 8〕染色 9)脱色 10)观察结果SDS电泳的关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。

三结果分析与评价
观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。

此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯洁的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

如果凝色谱柱装填得很、别离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果区带歪曲、散乱、变宽，说明别离的效果不好，这与凝色谱柱的装填有关。

讨论：如何测蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝电泳测蛋白质的分子量时，可选用一组分子量的蛋白同时进行电泳，根据分子量的蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作曲线，可以测未知蛋白质的分子量。