高效液相色谱法测定大米中的维生素B_1
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2 结果与分析
2. 1 维生素 B1 的定性与定量 精确称取 100 mg 维生素 B1 溶于 0. 1 mol / L 盐
酸中，并稀释至 1000 mL，配制成 100 μg / mL 的标准 储备液。吸取上述标准储备液 1 mL，用 0. 1 mol / L 盐酸稀释至 100 mL，配制成 1 μg / mL 的标准中间 液。分别吸取 0. 00、0. 25、0. 50、1. 00、1. 25、2mL 标 准中间液于 25 mL 具塞比色管中，再依次加入 0. 1 mol / L 盐酸 10、9. 75、9. 50、9. 00、8. 75、8mL，再分别 加入 5 mL 碱性铁氰化钾，充分混匀后，加入 10 mL
质量安全
高效液相色谱法测定 大米中的维生素 B1
曹 阳，刘美辰
（ 北京市粮油食品检验所，北京 100162）
摘 要： 大米中的维生素 B1 经酸解、酶解、氧化、萃取后，采用高效液相色谱法，经过 C18 色谱柱，以 甲醇∶ 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） = 35 ∶ 65 作流动相，用荧光检测器进行检测。结果表明， 维生素 B1 在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内具有较好的线性关系，检出限为 0. 65 ng / mL，三个浓度水平 的加标回收率均在 95% 以上，6 次平行试验的相对标准偏差为 2. 93% ，t 检验表明本方法与 GB / T 7628—2008 法之间无显著性差异。 关键词： 大米； 维生素 B1； 高效液相色谱 中图分类号： TS 210. 7 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 06 － 0071 － 03
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粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 6 期
正丁醇，剧烈振荡后静置分层，吸取正丁醇相溶液过 0. 2 μm 有机滤膜，所得样液进高效液相色谱中进行 测定。
对维生素 B1 用标准样品进行确认，维生素 B1 的标准物质出峰图如图 1 所示。
图 1 维生素 B1 的标准物质出峰图
色谱峰的出峰时间是一个定性指标，反映了被 测组分与 色 谱 柱 发 生 的 相 互 作 用［7］。 保 留 时 间 是 定性的一个重要依据。在相同的色谱条件下，维生 素 B1 的出峰时间在 6. 27min 左右，保留时间稳定， 可以很好地对维生素 B1 进行定性。
根据高效液相色谱中的标准样品峰面积与维生 素 B1 含量的关系进行线性回归，峰面积与维生素 B1 浓度在一定范围内呈线性关系。
图 2 维生素 B1 标准曲线 注： 标准曲线的回归方程 y = 613. 38x + 0. 4506，相关系数 r2 = 0. 9991。其中 y 为峰面积，x 为维生素 B1 浓度，μ g / mL。
色 谱 柱： YWG － C18 柱； 流 动 相： 甲 醇 与 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） 之比为 35： 65； 柱温： 40 ℃ ； 流速： 1. 0 ml / min； 检测波长： 激发波长为 365 nm，发射波长为 435 nm； 进样量： 10 μL。 1. 3. 3 比对实验
表 2 维生素 B1 回收率实验结果
加标量 / （ mg·kg － 1 ）
本底值 / （ mg·kg － 1 ）
测定值 / （ mg·kg － 1 ）
回收率 / %
0. 50 1. 00 2. 00
0. 95 0. 95 0. 95
1. 43 1. 46 1. 44 1. 43 1. 42 1. 42 1. 89 1. 93 1. 92 1. 92 1. 96 1. 94 2. 94 2. 92 2. 97 2. 91 2. 93 2. 96
96 102
98 96 94 94 94 98 97 97 101 99 99. 5 98. 5 101 98 99 100. 5
由表 2 可以看出，三个水平的加标实验回收率 在 94% ～ 102% 之间，符合 GB / T 27404—2008《实验 室质量控制规范 食品理化检测》［10］中对回收率的 要求，表明本方法的准确度满足检测的要求。 2. 3 对比实验结果
称取 5 g 过 60 目筛的大米试样，置于 100 mL 具塞三角瓶中，加入 50 mL0. 1 mol / L 盐酸溶液，摇 匀，放入沸水浴中 保 持 30 min，冷 却 至 室 温。用 2 mol / L 乙酸钠调 pH 值为 4. 5，而后加入 10 mL 混合 酶液（ 0. 01 g / mL 淀粉酶 + 0. 02 g / mL 蛋白酶） ，于 45 ～ 50℃ 保温箱中保温酶解 16 h。冷却至室温，定 容至 100 mL，摇匀。用滤纸过滤，弃去初始 5 mL 滤 液后再收集滤液于试管中。取滤液 10 mL 于 25 mL 具塞比色管中，加入 5 mL 碱性铁氰化钾，充分混匀 后，加入 10 mL 正丁醇，剧烈振荡后静置分层，吸取 正丁醇相溶液过 0. 2 μm 有机滤膜，供进样用。 1. 3. 2 色谱条件
收稿日期： 2014 － 05 － 9 作者简介： 曹阳，1985 年出生，女，工程师，硕士．
目前，我国常用的分析大米中维生素 B1 的方法 为 GB / T 7628—2008《谷物中维生 素 B1 测 定》［5］。 该方法操作过程相当复杂，所需检测时间较长。本 试验对国标方法进行了改进。维生素 B1 对酸稳定， 在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外 光激发下，噻嘧色素发出荧光，在无其它荧光物质干 扰情 况 下，荧 光 强 度 与 维 生 素 B1 含 量 成 正 比［6］。 在此原理的基础上，建立高效液相色谱测定大米中 维生素 B1 的测定方法。
平均值 / （ mg·kg － 1 ）
0. 96
相对标准偏差 /%
2. 93
由表 1 可 以 看 出，6 次 平 行 测 定 的 平 均 值 为 0. 96 mg / kg，相对标准偏差为 2. 93% 。相对标准偏 差低于 5% ，表明本方法的精密度满足检测的要求。
方法的 回 收 率 反 映 了 测 定 方 法 的 准 确 度［9］。 为了考察方法度准确度，通过对同一种大米样品分 别添加 0. 5、1. 0、2. 0 mg / kg 维生素 B1 的标准品，做 低、中、高 三 个 浓 度 水 平 的 加 标 回 收 试 验，按 照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的 方 法 进 行 测 定，所 得 回 收 率 见 表 2。
色谱峰的峰面积大小是定量分析的指标，表示 被测组分 在 样 品 中 含 量 的 高 低［7］。 色 谱 峰 的 峰 面 积越大，被测组分在样品中的含量越高。由图 2 可 以看出，在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内，维生素 B1 的 标准曲线的相关系数大于 0. 999，具有较好的线性 关系，从而保证了定量的准确。取维生素 B1 的标准 溶液按选定的色谱条件测定，根据 3 倍信噪比计算 得到此方法的检出限为 0. 65 ng / mL。 2. 2 方法的精密度与准确度
为了检验本方法和国标方法是否存在显著性差异可用检验法11结果见96mg的含量为095mg本方法和国标方法的组内统计和t检验结果组别试验次数平均值mgkg方差方程的levene检验均值方程的028国标方法859为了检验本方法和国标方法之间是否存在显著性差异先对这两种方法的方差进行613
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 6 期
Determination of vitamin B1 in rice by high performance liquid chromatography
CAO Yang，LIU Mei － chen （ Beijing Grain and Oil Food Inspection Institute，Beijing 100162）
Laboratory Mill 3100 型 旋 风 磨： Perten Instruments AB； AB204 － N 型 电 子 分 析 天 平： METTLEＲ 公司； DSY － 1 － 4 型电热恒温水浴锅： 北京国华医 疗器械厂； PYX － DHS － 40X50 型隔水式电热恒温 培养箱： 上海市跃进医疗器械厂； 高效液相色谱仪 （ 配荧光检测器） ： Agilent 公司。 1. 3 方法 1. 3. 1 样品前处理
Abstract： The vitamin B1 in rice was extracted by acid hydrolysis，enzymatic hydrolysis and oxidation． A C18 column was used for separation and elution． The mobile phase was methanol and sodium acetate （ 0． 05 mol / L，pH = 4． 5，35∶ 65） ． The vitamin B1 was detected by fluorescence detector quantificationally． The results showed that vitamin B1 had a good linear relationship in the concentration range of 0 ～ 0． 20 μg / mL． The detection limit was 0． 65 ng / mL． The recoveries of the three levels were above 95% ． The relative standard deviations were 2． 93% （ n = 6） ． There was no conspicuous difference between the result by this method and the result by the method described in GB / T 7628 － 2008． Key words： rice； vitamin B1 ； high performance liquid chromatography
维生素 B1 （ VB1 ） 又称硫胺素或抗脚气病维生 素。维生素 B1 参加细胞中的糖代谢，对于神经细胞 膜对兴奋的传导作用起着重要作用［1］。维生素 B1 在体内储存 量 极 少，如 果 摄 入 量 不 足，会 引 起 脚 气 病。维生素 B1 缺乏，主要损害神经血管系统，导致 多发性末梢神经炎及心脏功能失调［2］。维生素 B1 广泛分布于动植物界中，谷物是我国人民的主食，也 是我国传统膳食中维生素 B1 的主要来源［3］。大米 中含有丰富的维生素 B1 ，是我们摄取维生素 B1 的 主要途径。而且，随着《预包装食品营养标签通则》 的实施，维生素 B1 成为评价大米营养品质的重要指 标之一［4］。因此，准确测定大米中维生素 B1 的含 量具有现实意义。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 大米样品： 采用吉林 2011 年产的粳稻谷加工成
国标三级粳米，并粉碎过 60 目筛。 维生素 B1 标准品： 中国计量科学研究院； 淀粉
酶（ 酶 活 力 ≥50 U / mg） 、蛋 白 酶 （ 酶 活 力 ≥6 000
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质量安全
U / mg） ： Sigma 公司； 盐酸 （ 分析 纯） 、乙 酸 钠 （ 分 析 纯） 、铁氰化钾（ 分析纯） 、正丁醇（ 分析纯） ： 国药集 团化学试剂有限公司； 甲醇（ 色谱纯） ： Fisher Scientific 公司。 1. 2 主要仪器与设备
精密度是保证准确度的先决 条 件［8］。为 了 考 察方法的精密度，按照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的方法对同
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质量安全
一大米样品进行 6 次平行测定，测定结果见表 1。
表 1 维生素 B1 重现性试验结果
试验序号
1
2
3
4
5
6
测定值 / （ mg·kg － 1 ） 0. 97 0. 93 0. 94 0. 93 0. 97 1. 0
按照 GB / T 7628—2008 中的方法，对同一大米 样品 进 行 测 定。用 t 检 验 法 分 析 本 方 法 与 GB / T 7628—2008 中的方法是否存在显著性差异。 1. 3. 4 数据分析方法
使用 OriginPro 7. 5 和 SPSS 11. 0 对数据进行统 计分析。
2. 1 维生素 B1 的定性与定量 精确称取 100 mg 维生素 B1 溶于 0. 1 mol / L 盐
酸中，并稀释至 1000 mL，配制成 100 μg / mL 的标准 储备液。吸取上述标准储备液 1 mL，用 0. 1 mol / L 盐酸稀释至 100 mL，配制成 1 μg / mL 的标准中间 液。分别吸取 0. 00、0. 25、0. 50、1. 00、1. 25、2mL 标 准中间液于 25 mL 具塞比色管中，再依次加入 0. 1 mol / L 盐酸 10、9. 75、9. 50、9. 00、8. 75、8mL，再分别 加入 5 mL 碱性铁氰化钾，充分混匀后，加入 10 mL
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高效液相色谱法测定 大米中的维生素 B1
曹 阳，刘美辰
（ 北京市粮油食品检验所，北京 100162）
摘 要： 大米中的维生素 B1 经酸解、酶解、氧化、萃取后，采用高效液相色谱法，经过 C18 色谱柱，以 甲醇∶ 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） = 35 ∶ 65 作流动相，用荧光检测器进行检测。结果表明， 维生素 B1 在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内具有较好的线性关系，检出限为 0. 65 ng / mL，三个浓度水平 的加标回收率均在 95% 以上，6 次平行试验的相对标准偏差为 2. 93% ，t 检验表明本方法与 GB / T 7628—2008 法之间无显著性差异。 关键词： 大米； 维生素 B1； 高效液相色谱 中图分类号： TS 210. 7 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 06 － 0071 － 03
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正丁醇，剧烈振荡后静置分层，吸取正丁醇相溶液过 0. 2 μm 有机滤膜，所得样液进高效液相色谱中进行 测定。
对维生素 B1 用标准样品进行确认，维生素 B1 的标准物质出峰图如图 1 所示。
图 1 维生素 B1 的标准物质出峰图
色谱峰的出峰时间是一个定性指标，反映了被 测组分与 色 谱 柱 发 生 的 相 互 作 用［7］。 保 留 时 间 是 定性的一个重要依据。在相同的色谱条件下，维生 素 B1 的出峰时间在 6. 27min 左右，保留时间稳定， 可以很好地对维生素 B1 进行定性。
根据高效液相色谱中的标准样品峰面积与维生 素 B1 含量的关系进行线性回归，峰面积与维生素 B1 浓度在一定范围内呈线性关系。
图 2 维生素 B1 标准曲线 注： 标准曲线的回归方程 y = 613. 38x + 0. 4506，相关系数 r2 = 0. 9991。其中 y 为峰面积，x 为维生素 B1 浓度，μ g / mL。
色 谱 柱： YWG － C18 柱； 流 动 相： 甲 醇 与 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） 之比为 35： 65； 柱温： 40 ℃ ； 流速： 1. 0 ml / min； 检测波长： 激发波长为 365 nm，发射波长为 435 nm； 进样量： 10 μL。 1. 3. 3 比对实验
表 2 维生素 B1 回收率实验结果
加标量 / （ mg·kg － 1 ）
本底值 / （ mg·kg － 1 ）
测定值 / （ mg·kg － 1 ）
回收率 / %
0. 50 1. 00 2. 00
0. 95 0. 95 0. 95
1. 43 1. 46 1. 44 1. 43 1. 42 1. 42 1. 89 1. 93 1. 92 1. 92 1. 96 1. 94 2. 94 2. 92 2. 97 2. 91 2. 93 2. 96
96 102
98 96 94 94 94 98 97 97 101 99 99. 5 98. 5 101 98 99 100. 5
由表 2 可以看出，三个水平的加标实验回收率 在 94% ～ 102% 之间，符合 GB / T 27404—2008《实验 室质量控制规范 食品理化检测》［10］中对回收率的 要求，表明本方法的准确度满足检测的要求。 2. 3 对比实验结果
称取 5 g 过 60 目筛的大米试样，置于 100 mL 具塞三角瓶中，加入 50 mL0. 1 mol / L 盐酸溶液，摇 匀，放入沸水浴中 保 持 30 min，冷 却 至 室 温。用 2 mol / L 乙酸钠调 pH 值为 4. 5，而后加入 10 mL 混合 酶液（ 0. 01 g / mL 淀粉酶 + 0. 02 g / mL 蛋白酶） ，于 45 ～ 50℃ 保温箱中保温酶解 16 h。冷却至室温，定 容至 100 mL，摇匀。用滤纸过滤，弃去初始 5 mL 滤 液后再收集滤液于试管中。取滤液 10 mL 于 25 mL 具塞比色管中，加入 5 mL 碱性铁氰化钾，充分混匀 后，加入 10 mL 正丁醇，剧烈振荡后静置分层，吸取 正丁醇相溶液过 0. 2 μm 有机滤膜，供进样用。 1. 3. 2 色谱条件
收稿日期： 2014 － 05 － 9 作者简介： 曹阳，1985 年出生，女，工程师，硕士．
目前，我国常用的分析大米中维生素 B1 的方法 为 GB / T 7628—2008《谷物中维生 素 B1 测 定》［5］。 该方法操作过程相当复杂，所需检测时间较长。本 试验对国标方法进行了改进。维生素 B1 对酸稳定， 在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外 光激发下，噻嘧色素发出荧光，在无其它荧光物质干 扰情 况 下，荧 光 强 度 与 维 生 素 B1 含 量 成 正 比［6］。 在此原理的基础上，建立高效液相色谱测定大米中 维生素 B1 的测定方法。
平均值 / （ mg·kg － 1 ）
0. 96
相对标准偏差 /%
2. 93
由表 1 可 以 看 出，6 次 平 行 测 定 的 平 均 值 为 0. 96 mg / kg，相对标准偏差为 2. 93% 。相对标准偏 差低于 5% ，表明本方法的精密度满足检测的要求。
方法的 回 收 率 反 映 了 测 定 方 法 的 准 确 度［9］。 为了考察方法度准确度，通过对同一种大米样品分 别添加 0. 5、1. 0、2. 0 mg / kg 维生素 B1 的标准品，做 低、中、高 三 个 浓 度 水 平 的 加 标 回 收 试 验，按 照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的 方 法 进 行 测 定，所 得 回 收 率 见 表 2。
色谱峰的峰面积大小是定量分析的指标，表示 被测组分 在 样 品 中 含 量 的 高 低［7］。 色 谱 峰 的 峰 面 积越大，被测组分在样品中的含量越高。由图 2 可 以看出，在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内，维生素 B1 的 标准曲线的相关系数大于 0. 999，具有较好的线性 关系，从而保证了定量的准确。取维生素 B1 的标准 溶液按选定的色谱条件测定，根据 3 倍信噪比计算 得到此方法的检出限为 0. 65 ng / mL。 2. 2 方法的精密度与准确度
为了检验本方法和国标方法是否存在显著性差异可用检验法11结果见96mg的含量为095mg本方法和国标方法的组内统计和t检验结果组别试验次数平均值mgkg方差方程的levene检验均值方程的028国标方法859为了检验本方法和国标方法之间是否存在显著性差异先对这两种方法的方差进行613
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 6 期
Determination of vitamin B1 in rice by high performance liquid chromatography
CAO Yang，LIU Mei － chen （ Beijing Grain and Oil Food Inspection Institute，Beijing 100162）
Laboratory Mill 3100 型 旋 风 磨： Perten Instruments AB； AB204 － N 型 电 子 分 析 天 平： METTLEＲ 公司； DSY － 1 － 4 型电热恒温水浴锅： 北京国华医 疗器械厂； PYX － DHS － 40X50 型隔水式电热恒温 培养箱： 上海市跃进医疗器械厂； 高效液相色谱仪 （ 配荧光检测器） ： Agilent 公司。 1. 3 方法 1. 3. 1 样品前处理
Abstract： The vitamin B1 in rice was extracted by acid hydrolysis，enzymatic hydrolysis and oxidation． A C18 column was used for separation and elution． The mobile phase was methanol and sodium acetate （ 0． 05 mol / L，pH = 4． 5，35∶ 65） ． The vitamin B1 was detected by fluorescence detector quantificationally． The results showed that vitamin B1 had a good linear relationship in the concentration range of 0 ～ 0． 20 μg / mL． The detection limit was 0． 65 ng / mL． The recoveries of the three levels were above 95% ． The relative standard deviations were 2． 93% （ n = 6） ． There was no conspicuous difference between the result by this method and the result by the method described in GB / T 7628 － 2008． Key words： rice； vitamin B1 ； high performance liquid chromatography
维生素 B1 （ VB1 ） 又称硫胺素或抗脚气病维生 素。维生素 B1 参加细胞中的糖代谢，对于神经细胞 膜对兴奋的传导作用起着重要作用［1］。维生素 B1 在体内储存 量 极 少，如 果 摄 入 量 不 足，会 引 起 脚 气 病。维生素 B1 缺乏，主要损害神经血管系统，导致 多发性末梢神经炎及心脏功能失调［2］。维生素 B1 广泛分布于动植物界中，谷物是我国人民的主食，也 是我国传统膳食中维生素 B1 的主要来源［3］。大米 中含有丰富的维生素 B1 ，是我们摄取维生素 B1 的 主要途径。而且，随着《预包装食品营养标签通则》 的实施，维生素 B1 成为评价大米营养品质的重要指 标之一［4］。因此，准确测定大米中维生素 B1 的含 量具有现实意义。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 大米样品： 采用吉林 2011 年产的粳稻谷加工成
国标三级粳米，并粉碎过 60 目筛。 维生素 B1 标准品： 中国计量科学研究院； 淀粉
酶（ 酶 活 力 ≥50 U / mg） 、蛋 白 酶 （ 酶 活 力 ≥6 000
71
质量安全
U / mg） ： Sigma 公司； 盐酸 （ 分析 纯） 、乙 酸 钠 （ 分 析 纯） 、铁氰化钾（ 分析纯） 、正丁醇（ 分析纯） ： 国药集 团化学试剂有限公司； 甲醇（ 色谱纯） ： Fisher Scientific 公司。 1. 2 主要仪器与设备
精密度是保证准确度的先决 条 件［8］。为 了 考 察方法的精密度，按照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的方法对同
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 6 期
质量安全
一大米样品进行 6 次平行测定，测定结果见表 1。
表 1 维生素 B1 重现性试验结果
试验序号
1
2
3
4
5
6
测定值 / （ mg·kg － 1 ） 0. 97 0. 93 0. 94 0. 93 0. 97 1. 0
按照 GB / T 7628—2008 中的方法，对同一大米 样品 进 行 测 定。用 t 检 验 法 分 析 本 方 法 与 GB / T 7628—2008 中的方法是否存在显著性差异。 1. 3. 4 数据分析方法
使用 OriginPro 7. 5 和 SPSS 11. 0 对数据进行统 计分析。