麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用

麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用
李玲;卢芳国;熊兴耀;何迎春;朱应武;张薇;张波
【摘要】目的:通过观察麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠免疫器官重量指数和IL-2、TNF-β蛋白表达水平的影响,探讨该方对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用.方法:采用鼻腔接种法建立A型流感病毒小鼠肺适应株动物感染模型.实验设麻杏石甘汤组、利巴韦林组、抗病毒颗粒组、模型对照组和正常对照组,经灌胃给药或给生理盐水后,检测小鼠体重、肺指数、脾指数、胸腺指数和肺组织中IL-2、TNF-β的蛋白表达水平.结果:麻杏石甘汤明显提高A型流感病毒感染小鼠的体重、脾重指数、胸腺指数与肺组织中IL-2的蛋白表达水平,降低肺指数和肺组织中TNF-β的蛋白表达水平.结论:麻杏石甘汤通过提高小鼠免疫器官重量指数、调节细胞因子的蛋白表达水平而对流感病毒感染小鼠起保护作用.
【期刊名称】《中医药学报》
【年(卷),期】2010(038)002
【总页数】4页(P25-28)
【关键词】麻杏石甘汤;A型流感病毒;IL-2;TNF-β
【作者】李玲;卢芳国;熊兴耀;何迎春;朱应武;张薇;张波
【作者单位】湖南中医药大学,湖南,长沙,410208;湖南中医药大学,湖南,长
沙,410208;湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410208;湖南中医药大学,湖南,长沙,410208;湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410208
【正文语种】中文
【中图分类】R254;R285;R373.1+3
流感病毒(influenza Virus)有 A(甲)、B(乙)、C(丙)三型，A型流感病毒是人、禽、猪、马等多种动物流行性感冒(流感)的主要病原体。

流感属中医学时行感冒范畴，主要病因为外感风热毒邪，内袭于肺，基本病机为痰热壅肺、肺气失宣。

治疗当紧扣热毒、气郁、痰浊这三个基本环节。

麻杏石甘汤来自《伤寒论》，是辛凉解表剂的代表方，也是治疗感冒、支气管炎、大叶性肺炎等呼吸道感染的良方［1］。

前期研究结果表明:该方体外能通过直接杀伤病毒、干预病毒吸附、抑制病毒增殖、
保护宿主细胞、抑制宿主细胞凋亡等而发挥抗流感病毒作用［2－4］。

为探讨麻
杏石甘汤体内抗流感病毒作用及其机理，我们在前期研究基础上检测了该方对流感病毒感染小鼠的免疫保护作用，本文对其结果进行了分析报告。

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物麻杏石甘汤组方及其煎剂的制备方法参考国家中医药管理局统一组织编审的普通高等教育中医药类规划教材《方剂学》。

药材购自湖南中医药大学中医专家门诊部，煎剂浓缩至含生药2g/mL的药液。

利巴韦林片由江西江仁药业有限公司生产，批号:0601001，规格:每片0.1g。

抗病毒颗粒由四川光大制药有限公司生产，批号:z51020073，规格:每袋12g。

1.1.2 病毒株 A型流感病毒小鼠肺适应株(A/PR/8/34)由湖南师范大学病毒研究室
陈则教授惠赠。

经10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，微量血凝试验滴定病毒效价，血凝效价1∶640以上者可供试验用。

正式试验前测定小鼠病毒半数致死量(LD50)［5］，正式试验用50个单位的LD50(50 LD50)的病毒液。

1.1.3 动物 6～8周BALB/c小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心代购。

1.1.4 实验仪器超净工作台，微量加样器，麻醉缸，电子天平，YX型实验动物洁
净饲养柜，精密轮转切片机(RMZ135，德国LEICA)，电热恒温干燥箱(上海新苗医疗器械 DGH－9003型)，光学扫描显微镜+moticcam2306摄像头(ZEISS)，图像分析软件(Motic Advanced 6.0)。

1.1.5 试剂免疫组化小鼠IL－2、TNF－β多克隆抗体(一抗)、SABC二抗试剂盒，DAB显色试剂盒，苏木素、多聚赖氨酸(武汉博士德生物工程有限公司)，PBS缓
冲液，蒸馏水，中性树胶。

1.2 方法
1.2.1 制备模型实验动物适应性饲养2～3天后称重，除正常对照组动物外，其余
动物均制备成感染模型。

模型制备方法是:在乙醚轻度麻醉下，每只小鼠鼻内接种
50 LD50流感病毒液0.05mL［5］。

正常对照组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种生理盐水0.05mL。

1.2.2 动物分组实验设正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、抗病毒颗粒组、麻杏石甘汤组，每组12只小鼠。

1.2.3 给药方法利巴韦林组、抗病毒颗粒组、麻杏石甘汤组于感染后24小时开始
灌胃给药，每天1次，每次0.4mL，连续给7天。

正常对照组和模型对照组同步
灌胃给生理盐水0.4mL。

最后一次给药后禁水、禁食8小时，取标本进行指标检测。

动物给药剂量按动物每公斤体重占人体表面积的比值计算［7］。

1.2.4 标本采集及检测方法称动物体重后，处死动物，摘取胸腺、脾脏、肺脏，称重，计算脾指数、胸腺指数、肺指数、肺指数下降抑制率、体重下降抑制率［6］。

收集肺组织置于4%多聚甲醛液中固定，按常规脱水、石蜡包埋、切片，免疫组织化学染色法检测IL－2、TNF－β的蛋白表达水平，用光学扫描显微镜观察与扫描
图片，用图像分析软件(Motic Advanced 6.0)测定棕黄色颗粒的灰度值和阳性细
胞百分率，然后求其均值。

1.2.5 统计分析所有实验计量数据均以均数±标准差(±s)表示，用SPSS16.0统计
软件分析，组间显著性比较用t检验，以P<0.05表示差异在统计学上有显著性意义。

2 结果
2.1 麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠一般状况的影响与正常对照组比较，模
型对照组小鼠在感染病毒48h后表现精神沉郁，耸毛，卷缩，毛发无光泽，活动
减少，体重下降，畏寒怕冷，呼吸急促，呈明显的腹式呼吸等。

与模型对照组比较，麻杏石甘汤组小鼠精神良好，毛发光泽，活动较敏捷，呼吸、饮食正常，体重下降不明显。

2.2 麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠体重的影响由表1可知:小鼠感染流感病毒后体重明显降低，与正常对照组比较，差异显著(P<0.01)。

与模型对照组比较，麻杏石甘汤组、抗病毒颗粒组、利巴韦林组小鼠体重明显增加(P<0.01)，体重下
降抑制率分别为20.97%、21.54%、14.93%。

麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组的小鼠体重明显高于利巴韦林组(P<0.05)，麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组的小鼠体重
无差异显著(P>0.05)。

表1 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠体重的影响(±s，n=12)注:与正常对照组比较，P<0.01;与模型对照组比较，△△P<0.01;与利巴韦林组比较，○○P<0.01，○P<0.05;与抗病毒颗粒组比较，◆P>0.05。

2.3 麻杏石甘汤对A型流感病毒小鼠肺指数的影响
由表2可知:流感病毒感染小鼠肺指数明显增加，与正常对照组比较，差异显著
(P<0.01)。

与模型对照组比较，麻杏石甘汤组、抗病毒颗粒组、利巴韦林组肺指
数明显降低(P<0.01，P<0.05)，肺指数抑制率分别为32.83%、38.48%、
19.02%。

麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组小鼠肺指数明显低于利巴韦林组(P<0.01，P<0.05)，麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组小鼠肺指数无差异显著(P>0.05)。

表2 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠的肺指数的影响(±s，n=12)注:与正常对照组比较，P<0.01;与模型对照组比较，△△P<0.01，△P<0.05;与利巴韦林组比较，
○○P<0.01，○P<0.05;与抗病毒颗粒组比较，◆P>0.05。

2.4 麻杏石甘汤对A型流感病毒小鼠脾指数、胸腺指数的影响由表3可知:流感病毒感染小鼠的脾指数、胸腺指数明显下降，与正常对照组比较，差异显著
(P<0.01)。

与模型对照组比较，麻杏石甘汤组、抗病毒颗粒组小鼠脾指数和胸腺
指数明显增加，有显著差异(P<0.05，P<0.01)，利巴韦林组小鼠脾指数和胸腺指
数增加不明显，无显著差异(P>0.05);麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组小鼠脾指数和
胸腺指数明显高于利巴韦林组(P<0.01，P<0.05)，麻杏石甘汤组与抗病毒颗粒组
小鼠脾指数和胸腺指数无显著差异(P>0.05)。

表3 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠的脾指数、胸腺指数的影响(±s，n=12)注:与正常对照组比较，P<0.01，*P<0.05，※P>0.05;与模型对照组比较，△△P<0.01，▽ P>0.05;与利巴韦林组比较，○○P<0.01，○P<0.05;与抗病毒颗粒组比较，
◆P>0.05。

2.5 麻杏甘石汤对A型流感病毒小鼠肺组织IL－2、TNF－β蛋白表达水平的影响
由表4可知:流感病毒感染小鼠肺组织中IL－2蛋白表达水平降低，TNF－β蛋白表达水平升高，与正常对照组比较，差异显著(P<0.01)。

与模型对照组比较，利巴
韦林组、抗病毒颗粒组和麻杏石甘汤组小鼠肺组织中IL－2蛋白表达水平升高，TNF－β蛋白表达水平下降，差异显著(P<0.01)。

与利巴韦林组比较，抗病毒颗粒组和麻杏石甘汤组小鼠肺组织中IL－2蛋白表达水平升高，TNF－β蛋白表达水平下降，差异显著(P<0.01)。

与抗病毒颗粒组比较，麻杏石甘汤组小鼠组织中IL－2蛋白表达水平升高，差异显著(P<0.01)，麻杏石甘汤组与抗病毒颗粒组TNF－β
蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。

表4 麻杏甘石汤对流感病毒感染小鼠肺组织中IL－2、TNF－β蛋白表达水平的影响(±s，n=12)注:与正常对照组比较，P<0.01，*P<0.05;与模型对照组比较，
△△P<0.01;与利巴韦林组比较，○○P<0.01，○P<0.05;与抗病毒颗粒组比较，
◇◇P<0.01，◇P<0.05，◆P>0.05。

3 讨论
流感是常见的呼吸道感染性疾病。

流感病毒感染是否引起疾病取决于病毒与宿主之间的相互作用。

流感病毒侵入机体，在呼吸道上皮细胞中增殖，直接或间接损伤细胞导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起支气管炎和间质性肺炎。

病毒增殖产生的毒素样物质可导致高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等全身反应。

由于流感病毒感染会降低呼吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，因此流感后容易出现细菌等病原微生物的继发性感染。

流感后造成的继发性肺炎是流感的主要死因之一［5］。

本研究发现:流感病毒感染小鼠表现精神沉郁，耸毛，卷缩，毛发无光泽，活动减少，体重下降，畏寒怕冷，呼吸急促，肺脏水肿、充血、肺指数值明显增加，麻杏石甘汤组小鼠与模型对照组比较，一般状况得到改善，体重明显增加(P<0.01)，肺重指数明显下降
(P<0.01)，表明该方在体内有比较明显的抗流感病毒作用。

流感病毒及其多种抗原，如:包膜糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)具有较强的免疫原性，能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。

IL－2、TNF－β等是活化的细胞产生的细胞因子。

IL－2能促进胸腺细胞、T细胞和B细胞的增殖。

胸腺细胞和T细胞经抗原、有丝分裂原等刺激活化后，在有 IL－2存在的条件下进入S期，维持细胞的增殖，并产生多种细胞因子如IFN －γ、IL－4、IL－5、IL－6、TNF－β 及 CSF等。

IL－2还能诱导CTL、
NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能，活化巨噬细胞。

目前重组IL－2已用于肿瘤与活动性肝炎、单纯疱疹病毒感染、结核杆菌感染等感染性疾病等临床治疗。

TNF－β除具有抗肿瘤作用外，还有致热作用、促炎症反应等生物活性［9］。

本研究发现:流感病毒感染小鼠肺组织中IL－2蛋白表达水平降低，TNF－β蛋白表达水平升高，与正常对照组比较，差异显著(P<0.01)。

麻杏石甘汤组小鼠肺组织
中IL－2蛋白表达水平明显升高，TNF－β蛋白表达水平明显下降，与模型对照组比较，差异显著(P<0.05或P<0.01)。

表明该方具有影响流感病毒感染小鼠细胞因子蛋白表达水平，调节免疫网络的功能。

中医学认为“正气内存，邪不可干”，这里的正气包括了免疫功能在内的一切抗病能力，邪气则代表一切可导致人体功能紊乱，内环境失衡的因素。

正邪斗争的消长盛衰决定着疾病的发生、发展及其转归。

扶正与祛邪作为治疗疾病的一个基本原则。

胸腺、脾脏是机体的免疫器官，其功能与机体的免疫应答水平、免疫调节状况密切相关。

本研究发现:流感病毒感染后的小鼠胸腺重量指数、脾重量指数明显下降，
与正常对照组比较，差异显著(P<0.01)。

麻杏石甘汤组小鼠胸腺重量指数和脾重
量指数明显升高，与模型对照组比较，差异显著(P<0.01)。

表明麻杏石甘汤对流
感病毒感染小鼠的免疫器官有保护作用，这也应该是该方调节免疫应答的基础。

综上所述，麻杏石甘汤不但体内外有直接抗病毒作用，而且还具有保护免疫器官、调节细胞因子蛋白表达水平的功能。

由于中药复方成分复杂，作用靶点繁多，细胞因子在体内相互促进又相互制约，形成复杂的细胞因子调节网络。

因此，麻杏石甘汤抗流感病毒深层次的免疫学机理的研究还有待进一步开展。

参考文献:
［1］段富津.方剂学［M］.上海:上海科技出版社，2003:28－32，72－75.
［2］张薇，卢芳国，何迎春，等.麻杏甘石汤体外抗A型流感病毒作用的实验研
究［J］.实用预防医学，2007，14(5):1351 －1353.
［3］卢芳国，何迎春，肖子曾，等.麻杏甘石汤体外抗A型流感病毒的作用靶点［J］.湖南中医药大学学报，2008，28(2):5 －9.
［4］卢芳国，何迎春，肖子曾.麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的狗肾传代细胞
凋亡的影响［J］.医学研究生学报，2009，2(3):34－35.
［5］郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术［M］.北京:中国三峡出版社，1997:111－112.
［6］沈斯瑶，刘军辉，田艳茹，等.双黄连片对小鼠流感病毒和腺病毒感染的保护作用［J］.中国实用医药，2008，3(15):50 －51.
［7］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1997:1103.
［8］金伯泉.医学免疫学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:60－66.。