第十四章现代仪器分析简介

第三节 色谱法
一、色谱法发展简史 固定相（stationary phase）：按形状分为柱色 谱法，毛细管色谱法，平板色谱法；按材料 分为吸附色谱法，分配色谱法，离子交换色 谱法，凝胶色谱法，生物亲和色谱法 色谱柱 （packed column） 流动相（mobile phase）：气相色谱(gas chromatography，GC)；液相色谱(liquid chromatography，LC)；超临界流体色谱法 (supercritical fluid chromatography，SFC)
火焰法： CL 2Sb S 2Sb A C
石墨 炉法： mL CL V
第二节 荧光分析法
一、概述
荧光(fluorescence):当物质分子吸收光子能量
而被激发，然后从激发态的最低振动能 级返回到基态能级时所发射出的光 荧光分析法(fluorometry) :通过测定分子所发 射荧光的特征和强度，对物质进行定性、 定量分析的方法 分子荧光分析法（molecular fluorometry） :物 质在可见-紫外光区激发并发射的荧光
第十四章 现代仪器分析简介
学习目的要求
1.掌握原子吸收光谱法的原理、了解原子吸收光 谱仪的基本构造，熟悉标准曲线法及标准加 入法、熟悉灵敏度和检出限的计算方法。 。 2.熟悉激发光谱、发射光谱、荧光寿命、荧光效 率等概念，掌握荧光光谱的特点、影响物质 发光的因素及光强度与荧光物质浓度的关系， 了解荧光光谱仪的基本构造，熟悉标准曲线 法及比例法。 3.了解色谱分离理论、色谱仪的基本构造、进行 物质定性分析和定量测定的基本原理。
二、色谱仪
气相色谱仪示意图
高效液相色谱示意图
响应值与时 间的关系的 色谱图
三、色谱法分离理论 1、基本术语 色谱图(chromatogram) 以组分的响应值为纵坐 标，组分的流出时间为横坐标所得 基线（base line）当色谱柱中仅有流动相通过时， 检测器响应信号随时间变化的纪录，应是平行 于横轴的直线 色谱峰（chromatographic peak） 组分通过测试 器所得到的响应信号的大小随时间变化所形成 的峰形曲线。不正常的有：拖尾峰(tailing peak)及前延峰(leading peak)。
三、原子吸收光谱仪
光源
单色器
吸收池
检测器
显 示 器 显光源 -空心阴极灯(hollow cathode lamp)
2. 原子化器(atomizer) (1) 火焰原子化器 (2) 电热原子化器
3. 单色器：平面光栅单色仪
4. 检测系统 ：光电倍增管
四、测量分析方法 1、校准曲线法 (calibration curve) 2、标准加入法 (standardaddit ions)
物质分子产生荧光必需满足两个条件：在紫 外-可见光谱区有强吸收和具有较高的荧光 效率。 发射荧光的光子数 荧光效率 吸收激发光的光子数
f
影响荧光强度的 （1）具有长共轭结构的物 质具有较高的荧光效率（2）分子的刚性和 平面性可使荧光效率提高（3）各种取代基 对荧光效率有很大影响，吸电子取代基使 荧光效率降低，而斥电子取代基使荧光效 率提高。
16 (
tR W
)
2
5 . 54 (
tR W1
2
)
2
3、速率理论 色谱柱的柱效也就是峰宽受四个力学因素控制， 即涡流扩散项、分子扩散项、流动相和固定 相传质阻力项。用板高方程表示为：
H A B u Cu
A、B、C分别表示涡流扩散系数、分子扩 散系数、流动相和固定相传质阻力系数之 和。只有当A、B、C较小时，H才能小， 柱效才能高。反之柱效低，色谱峰将展宽。
第一节 原子吸收光谱法
一、概述 1. History: 2. Definition : AAS是基于光源辐射出待测元素的特 征谱线，通过样品的原子蒸气时，被蒸气中待测 元素的基态原子吸收，通过测量吸光度对元素进 行定量分析的方法。 二、原理 1.原子吸收光谱的产生 : = c/ = hc/h = hc/E 2.原子吸收测量的基本关系 A= -lgT = lg Iov / Iv =0.4343KNL
1、激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱(excitation spectrum)：固定某一
发射波长，测定荧光发射强度(F)随激发 波长(ex)变化所得的光谱 荧光发射光谱（emission spectrum）或荧光光 谱（fluorescence spectrum）：固定某一激 发波长，测定荧光发射强度随发射波长 变化所得的光谱
五、样品的处理
T
干燥-----灰化-----原子化----净化
drying
ashing
Time atomizing cleaning
六、灵敏度和检出限 1. 灵敏度 特征浓度(characteristic concentration)：产生 1%吸收（0.0044 A）所需浓度。 Sc = C ×0.0044 / A 特征质量(characteristic mass)： mc = C V×0.0044 / A 2. 检出限
二、光强度与荧光物质浓度的关系 It = Io10-bc Ia=Io - It F = Io(1-10-bc) = Io(1- e-2.303bc) 对于稀溶液，bc <0.02时： F = 2.303 Iobc =（2.303 Iob）c F=Kc
三、荧光光谱仪
四、定量分析方法及应用 1、校准曲线法：用已知浓度的标准物质经过和 未知样品相同的处理之后，配制溶液，逐一 测定荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准 溶液的浓度为横坐标绘制成标准曲线。在校 准曲线中查出对应浓度。 2、比例法：
cx F s Fo F x Fo cs
3、荧光分析法的应用 （1）无机化合物的分析：形成荧光螯合 物的直接分析法；被测物作为荧光熄灭 剂的荧光熄灭分析法 （2）有机化合物的荧光分析 ：芳香族及 具有芳香结构的化合物；还原型辅酶I （NADH）和还原型辅酶II（NADPH）； （3）荧光标记技术在生物医学研究中的应用： 常用溴化乙锭 EB
2、塔板理论 （1）理论塔板高度（Height equivalent to a theoretical plate；H）把色谱柱看作分馏塔， 每个塔板之间的距离。 （2）理论塔板数(The number of theoretical plates) 在一定柱长（L）中的塔板的数目（N）
N
L H
fs
W 0 . 05 h 2X

(X Y ) 2X
fs在0.95~1.05之间为对称峰；小于0.95为前延峰；
大于1.05为拖尾峰 峰高(h): 峰顶到基线的垂直距离；半峰宽(W1/2): 峰高一半处色谱峰的宽度；峰面积(A): A h×W1/2 保留时间(retention time；tR) 试样中各组分在色谱 柱中滞留的时间 死时间（void time；tM）：不被固定相吸附或溶 解物质从进柱到出柱出现响应值最大时t 调整保留时间（adjusted retention time；t’R）： 扣除了死时间之后的保留时间
4、分离度(resolution)
R
t R1
1 2
t R2


2 tR
W 1 W 2
W 1 W 2
四、色谱法中的定性和定量方法 1、定性方法 2、利用峰面积定量 3、色谱法分析中生物样品的预处理
课后练习 p308 1、3、6、9、10
本章小结
一、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于试样的基态原子蒸气 对特征辐射的吸收作用来进行元素定量分析的 方法。 原子吸收的测量 根据Lambert-Beer定律 原子吸收分光光度计 原子吸收分光光度计主要 由光源、原子化器、分光系统和检测系统等四 部分组成 定量分析方法 原子吸收光谱法常用的定量方法 有标准曲线法和标准加入法。
F
荧光波长407nm 386 366
F
407 430
激发光谱
荧光光谱
453
347
激发光波长386nm 350 375 400 400 430 460
2、荧光寿命和荧光效率 荧光寿命(fluorescence life time，f)：当除去激 发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最 大荧光强度的1/e所需的时间 荧光量子产率(fluorescence quantum yield，)：
Fo Ft t
ln


f
f
发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
3、影响物质发光的因素 （1）分子结构与荧光的关系 能够发射荧光的 物质应同时满足两个条件：物质分子必须有 强的紫外-可见吸收，有一定的荧光效率。分 子中有共轭 键、刚性平面结构、分子上的给 电子取代基使荧光增大，而吸电子取代基则 降低荧光强度。 （2）影响荧光强度的外部因素：若温度升高， 降低荧光效率和荧光强度；荧光波长随着溶 剂极性的增加而长移，荧光强度增加；溶液 的pH；荧光焠灭剂。
二、荧光分析法 激发光谱反映荧光强度随激发光波长的变化情况， 荧光光谱反映荧光强度随荧光波长的变化情况。 固定荧光波长，以激发光波长为横坐标，荧光 强度为纵坐标，可绘制物质的激发光谱；固定 激发光波长和强度，以荧光波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标，可绘制物质的荧光光谱。激 发光谱和荧光光谱可以用于对物质进行定性分 析，也可用于荧光测定时激发波长和测量波长 的选择。
影响荧光强度的外界因素: 温度升高,荧光强度 降低；溶剂极性增加,荧光强度增大,同时荧光 峰向长波长方向移动；pH值；荧光熄灭剂 荧光强度与溶液浓度的关系：当荧光物质浓度较 低，且符合abC≤0.02条件时，荧光强度与其 浓度呈线性关系：F = KC 荧光计或荧光分光光度计，一般由光源、单色器、 样品池、检测器和读数装置等元件组成。 荧光法的定量方法有标准曲线法或直接比较。