文物200408--北京市石景山区老山汉墓出土人类遗骸的线粒重点

北京市石景山区老山汉墓出土人类遗骸的线粒体DNA分析
吉林大学边疆考古研究中心
北京市文物研究所
本实验报告所报道的古人类遗骸出自2000年北京老山地区的一座西汉墓,墓主人为燕国某一代王后[1]。

2002年10月,吉林大学边疆考古研究中心和北京市文物研究所联合组成课题组,对老山汉墓出土的女性墓主人遗骸进行综合研究。

本文便是对该墓主人遗骸中线粒体DNA的分析报道。

一研究目的
考古DNA研究是近年来新兴的一个研究领域。

它通过分子生物学的方法和手段,对古代生物遗骸中保存下来的核酸序列进行分析,从而为古生物学和考古学提供有价值的生物学信息。

目前,古DNA的研究已取得了令人瞩目的成就。

例如1984年,Hi g uchi等人成功地从已灭绝100多年的斑驴标本中提取出线粒体DNA 片段[2]。

Ivanovt等对俄国末代沙皇尼古拉二世遗骸的古DNA进行研究,确定了其身份[3]。

Krings等从尼安德特人遗骸中提取出线粒体DNA(mtDNA,测定并分析其序列,证明尼安德特人只是现代人的旁系远亲,而非直系祖先[4]。

我国对古代DNA的研究刚刚起步,中国科学院遗传学研究所、中国社会科学院考古研究所和吉林大学等单位,对安阳殷墟、郑州西山、内蒙古龙头山和三道湾、河北姜家梁等遗址的古人骨进行DNA研究,已取得初步成效[5]。

古人类DNA研究主要包括两大方面———个体遗传关系的研究和群体遗传关系的研究。

通过对古人类DNA的分析,可以了解同一墓地不同墓葬中死者之间的遗传学关系,从而对当时的社会性质、社会组织结构作出科学推断。

而探讨不同考古学文化人群之间的遗传学关系。

为研究考古学文化之间关系以及各古代民族与现代民族之间的关系提供了科学依据。

人类mtDNA的无重组和母性单倍体遗传的特点,使其有效群体的大小仅为核DNA的四分之一,在高进化速率(约是核基因组的10~ 20倍和遗传随机漂变的作用下,产生了较高的地区群体差异,因而被广泛应用于研究人类群体的起源、演化和亲缘关系。

本实验通过对该样本的mtDNA高可变Ⅰ区进行序列多态性分析,以期探讨其种系归属问题。

二实验过程
1.样本处理和基因组DNA提取
·2004年第8期
全部样本均取自老山汉墓女性墓主人的遗骸,我们分别采集了左侧肢骨、干燥脑组织的不同部分,以及一颗前臼齿。

肢骨、脑组织的不同部分的样本首先在紫外光下暴露30分钟,而后除去样品表面3~5mm,牙齿则预先用1N 的盐酸处理。

接着,用特制的组织研磨机把古代样本粉碎成粉末。

DNA的提取使用古DNA 抽提专用试剂盒(BI0101,U SA,取500m g古代样本的粉末,用EDTA缓冲液裂解细胞,在高浓度的异硫氰酸胍下,用硅胶颗粒吸附DNA分子,经缓冲液冲洗,去除蛋白及脂类等大分子以及PCR反应抑制物后,用纯水洗脱。

2.DNA扩增及序列测定
PCR反应的引物为自行设计的四对套叠型引物(参见表一。

在25μL的体系中,将含有67mmol/L Tris-HCl(p H8.8,2mmol/L M g Cl2, 1mmol/L dNTPs,1mg/mL BSA 的预反应液,用0.5Unit DNasel25℃反应10分钟、85℃灭活10分钟后,加入0.5mol/L 各引物和1Uni t Ta q DNA 聚合酶,扩增33个循环,按以下程序进行:94℃热启动5分钟,92℃热变性1分钟,55℃退火45秒,72℃延伸1分钟。

PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳,经胶回收试剂盒(Qia g ene DNA胶回收试剂盒回收。

经检测后,以回收产物作为模板,采用ABI Bi g D y e Terminator C y cle Se q uencin g V2.0测序试剂盒,用正向和反向引物分别作测序反
应,反应产物按公司推荐的乙
醇沉淀法进行纯化和变性后,
经ABI310全自动基因分析仪
读取序列。

3.数据处理
DNA序列经软件Se-
q uencin g anal y sis3.7编辑(美
国PE公司,正反链核对后,
采用Clustal X1.8软件包进行
编辑,与剑桥标准序列
(Cambr idge reference se-
q uence,CRS进行了序列的排列比较,分析其突变位点,由此判定其单倍型类群(ha p lo g r ou p归属。

古代个体mtDNA高可变Ⅰ区(h yp ervar iable segment I,HVSI的序列在GenBank中,通过BL AST寻找其共享序列,判定这些序列的分布情况。

三结果与讨论
1.结果的真实性
古代DNA的特点是高度降解、广泛损伤而且含量极低。

该样本埋藏条件较差,遗骸有灼烧痕迹,因此我们采取以下措施,避免外源DNA的污染。

一方面,在采集过程中,样本被分别收集在不同的无菌袋中。

处理样本时,先用紫外线照射或盐酸处理
表面,而后打磨去外层3~5mm。

在抽提、扩增过程中,平行进行了多个空白对照。

对PCR反应液都采用DNasel预处理,以降解试剂或操作中可能引入的外源DNA 污染。

另外,我们建立了独立的实验区域,使用一套专用的微量取样器,以防止扩增DNA间的交叉污染。

为了把污染的可能性降到最低,我们做了擦拭实验来检测环境的洁净度。

另一方面,实验结果的可重复性能够直接反映它的真实性。

对此,我们设计了重复实验方案,对不同部位(前臼齿、肢骨、脑组织分别取样抽提。

对同一抽提产物,由不同实验员在间隔较大时间跨度(2个月分别进行扩增,
目的是排除操作
图一老山汉墓样本序列和剑桥标准序列的比对
人员和环境造成的影响。

每个扩增产物正反测序两次,以减少序列判读的误差。

最后以得到的平行实验结果为准。

由于该个体的肢骨、牙齿保存情况欠佳,未能从中提取出DNA,但我们成功地从干燥脑组织的3个不同部位得到了古DNA模板,并扩增测序。

实验结果表明,3个不同部位所得序列均一致;同一抽提产物,平行测序结果均相同。

因此我们认为,该序列真实地反映了老山汉墓女性墓主人遗骸的遗传信息。

2.单倍型类群的判定
mtDNA控制区(contr ol region的高可变区不编码蛋白,在进化过程中选择压力相对较小,变异率较高。

因此,现在对于古代DNA的研究主要选择在控制区内的高可变Ⅰ区。

本实验成功地扩增出了高可变Ⅰ区的300b p左右片段与CRS对照,共检测出4个多态性位点,包括16192位(C※T、16223位(C※T、16260位(C※T和16111位点的插入。

序列比对结果如下(图一。

由于该序列具有16223位(C※T的突变,根据高可变Ⅰ区分型原则,它应属于单倍型类群的M世系,而M世系被认为是东亚人群起源的古老单倍型类群[6]。

群体遗传学研究表明,亚洲人群中的单倍型类群M与东非人群中的M 类群约在6万年前分开,迁入亚洲的M类群随后发生了群体和地理上的扩张。

在将该序列与现有的线粒体基因库中序列做比对时,没有找到与其一致的序列。

在将16111位点T作为插入而不考虑的情况下,有2例与它只相差一个碱基(bp 的序列,它们分别为g i|1596021|db j|D84875.1|(韩国和
gi|21280111|dbj|AB048451.1|(日本[7]。

因此,老山汉墓的序列应属于亚洲谱系。

在探讨插入的另一种情况时,若将16111位点作为C/T的突变,而不考虑16112位点C插入,有3例与之相差一个碱基(b p的序列g i| 8099619|gb|AF249844.1|AF249844(印度, g i|8099618|g b|AF249843.1|AF249843(印度[8],g i|402117|g b|L20165.1|HUMMT-
NA065(北美土著[9]。

这些序列在与之相对的引用文献的分型中,依然将其归入亚洲谱系[10]。

综上所述,老山汉墓女性墓主人的DNA序列属于亚洲M谱系,代表了东亚地区现代人群的某种祖先类型的遗传学性状。

这与体质人类学研究结果基本一致,说明两种方法可以相互验证、相互补充。

随着古DNA研究的不断深入以及古DNA数据库的不断丰富,我们希望能与同时期古DNA序列进行横向分析,以克服“时间陷阱”。

执笔:杨亦代高诗珠
段然慧周慧
赵福生朱泓
[1]王鑫、程利《石景山区老山汉墓》,《中国考古学年
鉴(2001》,文物出版社,2002年。

[2]Higuchi R.,Bowman M.,Freib erger M.et al.,
DNA se q uences from the q ua gg a,an ext in ct
member of t he h orse f amily.Natur e,1984,312:
282-284.
[3]IvanovPL K et al.,M it ochondrial se q uence h etero-
plas my in t he Grand Duk eof Ru ssia
Georgij 北京市石景山区老山汉墓出土人类遗骸的线粒体N DA分析·2004年第8期
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[4]Krin g s M.,Stone A.,S ch mitz R W.et al.,Ne-
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n orth ern Cau casus.Natu r e,2000,404:490-493.
[5]崔银秋、段然慧、周慧、朱泓《新疆古车师人线粒
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[7]Horai,S.,M urayama,K.,Hayas ak a,K.et al.,
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[9]S hield s G.F.,Schmiech en A.M.,Frazier B.L.
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t ion ar y diver g en ce for Berin g ian and nort hern North American popul ations.Am.J.Hum.
G en et.,1993,53(3:549-562.
[10]群体遗传学通过对北美土著的线粒体遗传数据
的系统发育进行分析,认定在人类迁徙史上,曾
出现过从亚洲北部经白令海峡到达北美的大规
模古人群迁徙,所以北美土著的一部分应属于
亚洲谱系。

参见姚永刚、张亚平《线粒体DN A和
人类进化》,《动物学研究》2000年第5期,第
392~406页。

(责任编辑:郑彤
Anal y sis of Mitochondrial DNA from the Han D y nastical Tomb of
Laoshan Site in Bei j in g
Research center for Chinese Frontier Archaeolo gy of Jilin Univ ersit y
The Institute of Cultural Relics of Beijing City
Ancient DNA molecules wer e succ essfully extracted from remains of Laoshang tomb.PCR ampli-fication and se q uencin g anal y sis of mitochondr ial h yp ervar iable re g ionⅠ(16035-16398wer e carr ied out to determine its ha p lo g rou p.The r esults indicate the se q uence belon g s to M ha p lo g rou p attr ibuted to Asian which consists wi th the stud y of p h y sical anthro p olo gy.The p ro j ect acertained its linea g e and meanwhile enr iched the database of ancient populations in China.。