橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶基因CgATPase 01的敲除及表型分析

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橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶基因CgATPase 01的敲除及
表型分析
刘先宝;李博勋;孙懂懂;时涛;黄贵修
【摘要】To understand the function of cadmium-translocating P-type ATPase gene CgA TPase 01 in Colletotrichum gloeosporioides from rubber tree,the Split-marker strategy was applied to build a knockout cassette.The transformants which knocked out CgA TPase 01 gene were obtained through PEG-mediated protoplast transformation.The function of CgA TPase 01 gene was analyzed according to the phenotype and pathogenicity detection of the mutant.Results:The muta nt of ΔCgATPase 01 was obtained by Split-Marker method.The phenotypic analysis revealed that there was significant difference between Δ CgATPase 01 and wild type.The mutant had a slower growth rate on plates,and reduced conidiation compared to the wild-type strain.Additionally,the mutants showed decreased pathogenicity to rubber tree.Therefore the CgATPase 01 gene in C.gloeosporioides plays an important role on
conidiation,growth and pathogenicity.This study would lay a foundation for further study on the function of P-type ATPase gene and the pathogenic mechanism in C.gloeosporioides.%为了了解橡胶树胶孢炭疽菌的一个钙转运P型ATP酶基因CgA TPase01的功能,本研究利用Splitmarker技术构建敲除载体,通过PEG介导原生质体转化对橡胶树胶孢炭疽菌菌株HBCg01的CgA TPase 01基因进行敲除,根据表型变化及致病性检测对其功能进行分析.结果表明:通过Split-marker方法获得了敲除突变体△CgA TPas e01,表型分析发现该突
变体与野生菌株间存在明显差异,病菌气生菌丝的颜色发生了改变,生长速率降低,产孢量下降,对橡胶树叶片的致病性减弱,推测该基因可能在橡胶树胶孢炭疽菌的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用.本研究结果为进一步研究胶孢炭疽菌P型ATP酶基因功能和病原菌的致病机理奠定了基础.
【期刊名称】《热带作物学报》
【年(卷),期】2017(038)005
【总页数】7页(P903-909)
【关键词】胶孢炭疽;P型ATP酶基因;敲除;表型分析
【作者】刘先宝;李博勋;孙懂懂;时涛;黄贵修
【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带农林有害生
物入侵监测与控制重点开放实验室海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室
海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带农林有
害生物入侵监测与控制重点开放实验室海南省热带农业有害生物检测监控重点实
验室海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室海南省热带农业有害生物检测监控重
点实验室海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室海南省热带农业有害生物检测监
控重点实验室海南海口 571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室海南省热带农业有害生物检
测监控重点实验室海南海口 571101
【正文语种】中文
【中图分类】S432
doi10.3969/j.issn.1000-2561.2017.05.019
炭疽病是橡胶树的重要病害之一,该病于1906年在斯里兰卡首次被发现,之后在世界各大橡胶树种植区相继被报道。

中国于1962年在海南国营大丰农场苗圃首次发现炭疽病,现在中国橡胶主要种植区广东、广西、云南和海南等省均有不同程度发生,与白粉病并称为“两病”,每年都给天然橡胶产业带来了巨大损失。

橡胶树炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)2种,其中胶孢炭疽菌为主要病原菌[1]。

目前,已有许多学者对胶孢炭疽菌致病相关基因开展了大量研究。

胶孢炭疽菌侵染植株过程中许多阶段的致病相关基因已经得到了克隆,如孢子附着基质基因
chip1[2]、附着胞形成时期的cap3、cap5、cap20、cap22、CUT1以及chip6基因[3-6]、构成细胞骨架的微管蛋白基因[7]、营养阶段的有关基因gln和CgDN24[8]、活体营养阶段CgDN3基因[9]、死体营养阶段的pel、pelB[10]及G蛋白信号调控因子CgRGS2基因[11]等都是病原菌致病性相关基因。

PAC1基因表达产物能够调节胶孢炭疽菌对pH的敏感性,PAC1基因的缺失可下调PELB 基因表达,降低PELB基因的表达产物裂解酶的产生,进而减弱了炭疽病菌的毒力作用[12]。

CgATG8是病原真菌细胞自噬过程中的重要基因,该基因缺失后,橡胶树胶孢炭疽菌的致病力丧失,孢子萌发和附着胞的形成延迟[13]。

P型ATP酶是一类可以被ATP驱动而发生磷酸化的阳离子泵,普遍存在于各种生物中,参与生物体的许多重要过程。

根据底物特异性P型ATP酶超级家族可以将其分为5个主要亚家族和10个亚型[14-16]。

研究表明,在植物病原真菌中,P型ATP酶家族基因除了参与离子运输和细胞信号转导等,部分P型ATP酶还与病原菌的生长发育和致病性相关。

在前期工作中,通过对胶孢炭疽菌(HBCg01)全基因组数据库进行tblastn搜索
和候选基因结构域分析及功能预测,获得了一个新的Ca2+转运P型ATP酶候选
基因CgATPase 01[17],基因和编码的氨基酸序列与已报道的P型ATP酶都存在明显差异。

为了深入了解该基因的功能,本研究采用Split Marker重组技术敲除
目的基因CgATPase 01,用PCR和分子杂交方法确认敲除突变体,分析其对菌株产孢量、生长和菌落形态等特征及致病力的影响。

研究橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶不仅有助于了解病原菌的致病机理,而且可为制定病害的有效防治策略提
供依据。

1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒用于橡胶树胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)全基因组测序的野生型菌株HBCg01和PCSN43质粒均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带工业原料作物病害课题组保存。

1.1.2 引物设计通过对橡胶树胶孢炭疽菌(HBCg01)全基因组数据库进行tblastn 搜索,获得CgATPase 01基因及上下游各1 000 bp序列;根据Split Maker原理,利用CgATPase 01基因和潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列设计引物,本实验所用引物均由华大基因股份有限公司合成,引物序列见表1。

1.1.3 培养基及试剂PDA培养基(马铃薯200g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂18 g/L,不加琼脂为PDB培养基);CM培养基(酸水解酪蛋白1 g/L,蔗糖10 g/L,酵
母提取物6 g/L,固体培养基中加18~20 g/L琼脂粉);LR培养基(酸水解酪蛋白1 g/L,酵母提取物1 g/L,蔗糖342.2 g/L);SR培养基(在LR培养基中加
7 g/L琼脂糖);CZAPEK培养基(硝酸钠2.0 g/L,磷酸氢二钾1.0 g/L,氯化钾0.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸亚铁0.01 g/L,蔗糖30.0 g/L,配固体培养基时
加18~20 g/L琼脂粉);0.7 mol/L氯化钠溶液;潮霉素(Hygromycin B 50 mg/mL,德国Roche公司);STC溶液[山梨醇1.2 mol/L、氯化钙0.5%、Tris-HCl 100 mmol/L(pH7.0)、EDTA 25 mmol/L];PTC溶液[将40%(W/V)
PEG3350溶于STC溶液,用过滤器(孔径0.2 μm)进行过滤];溶壁酶(Lysing Enzyme 40 mg/mL,广东省微生物研究所);地高辛试剂盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche,Mannheim,Gemany)。

1.2 方法
1.2.1 野生型菌株基因组DNA和质粒DNA的提取
将HBCg01菌株接种于PDB培养基,于180 r/min、28℃摇床震荡培养5 d,过滤收集菌丝体用于基因组DNA提取,采用CTAB法[18]。

用TIAN prep Rapid Mini Plasmid Kit(快速质粒小提试剂盒)进行质粒DNA的提取。

1.2.2 基因敲除盒的构建以野生菌株基因组DNA为模板,利用引物1F/2R(其5′
端包含27bp潮霉素基因hph左端序列)和3F/4R(其5′端包含27 bp潮霉素基因hph右端序列)扩增获得CgATPase 01基因同源左臂和右臂。

利用HYG/F和HY/R以PCSN43质粒DNA为模板扩增得到潮霉素基因(hph)左片段;利用
YG/F和HYG/R以PCSN43质粒DNA为模板扩增得到潮霉素基因(hph)右片段。

利用Split-Marker方法,以1F和HY/R为引物,以1F与2R扩增产物和HYG/F与HY/R扩增产物共同为模板,扩增得到CgATPase 01基因敲除载体左
片段;以YG/F和4R为引物,以3F与4R扩增产物和YG/F与HYG/R扩增产物
共同为模板,扩增得到CgATPase 01基因敲除载体右片段。

1.2.3CgATPase01基因敲除与转化子的筛选鉴定
参照时涛等[19]的方法制备野生型菌株HBCg01原生质体;在无菌条件下向装有200 μL原生质体的50 mL离心管中加入待敲除基因的敲除载体左右片段(约2
μg),轻轻混匀后冰上放置20 min;逐滴滴加2 mL PTC溶液,冰上放置20 min;加入25 mL冰预冷的STC,轻轻混匀,以4℃、2 000 g离心15 min,弃
去上清;每管加入3 mL LR培养基,28℃静置培养12 h;将复苏的原生质体转入培养皿中,每管倒3个培养皿,再加入约20 mL冷却至50℃左右的含潮霉素的
SR培养基,轻轻晃动混匀;于28℃培养4~6 d,将长出的转化子转至SR培养基(内含300 μg/mL潮霉素Hygromycin B)上进行再次筛选,并确定其潮霉素抗性。

对所获得的具有潮霉素抗性的转化子进行DNA提取以后,利用3对引物
5F/HY/R、YG/F/6R和5F/6R对其进行PCR验证,以野生型为对照。

大量提取转化子基因组DNA,选用标记基因(HYB)和目标基因中都没有酶切位点的限制性内切酶EcoRⅠ酶切基因组DNA;以质粒pCSN43为模板、HA和HB 为引物进行PCR扩增,得到目的片段,将其做为探针,按照地高辛试剂盒说明书方法进行Southern杂交,进一步验证敲除转化子。

1.2.4CgATPase 01基因敲除突变体表型观察和致病力检测从培养5 d的胶孢炭疽菌野生型菌株和转化子菌落外围切取菌饼(菌饼直径大小约为0.7 cm)接种于PDA培养基中,于28℃自然光下培养,每24 h测量一下菌落直径并观察菌落形态特征;接种6 d后再次测量菌落直径。

每个菌株接种3个重复。

将胶孢炭疽菌野生型菌株和转化子接种在CZAPEK固体培养基上培养7 d,用无菌水和灭菌的棉签清洗孢子,涡旋震荡混合均匀,用血球计数板统计孢子数量,并观察孢子形态。

每个菌株做3个重复。

选择感病橡胶树品种文昌11的古铜期叶片用于致病性测定,利用野生型HBCg01和CgATPase 01基因缺失突变体的孢子悬浮液(孢子浓度为1×106个/mL)对橡胶树古铜色离体叶片进行点接种,保湿4 d后观察记录发病情况并拍照。

2.1Split-Marker法构建CgATPase 01基因敲除盒
利用引物1F/2R(其前端包含27 bp潮霉素基因左端序列)获得339 bp的CgATPase 01基因同源左臂;利用3F/4R引物扩增获得330 bp的同源右臂(如图1-A所示)。

利用YG/F和HYG/R扩增得到918 bp的潮霉素基因(hph)左片段,利用HYG/F和HY/R扩增得到798 bp的潮霉素基因(hph)右片段(如
图2-B所示)。

利用引物1F和HY/R扩增获得1 137 bp的CgATPase 01基因
敲除盒左片段,以YG/F和4R为引物,以3F与4R和YG/F与HYG/ R扩增的产物为共同模板,扩增得到1 248 bp的CgATPase 01敲除盒右片段(如图3-C所示)。

2.2CgATPase 01基因敲除转化子的筛选鉴定
将获得的敲除盒的左右片段通过PEG介导转入HBCg01原生质体后,在含有潮霉素的SR培养基中培养,经过筛选获得了19个具有潮霉素抗性的疑似CgATPase 01敲除转化子。

根据3对引物扩增结果可知,引物5F与HY/R和YG/F与6R在敲除转化子中扩出的片段大小分别为1 313 bp和1 557 bp,在野生型中未扩增
出片段,由于同源置换,目的基因会被1 400 bp左右的潮霉素基因所替换掉,引物5F和6R在敲除转化子中扩增出的片段为2 554 bp,小于野生型中扩增出的3 693 bp。

19个疑似敲除转化子经过这3对引物扩增后有5个可能为敲除转化子,分别标记为ATP01-2、ATP01-4、ATP01-8、ATP01-11和ATP01-13(如图2-
A和图2-B)。

利用Southern杂交进一步验证转化子,结果发现只有转化子
ATP01-13为单位点置换(如图2-C),确定该转化子为CgATPase 01基因敲除突变体△CgATPase 01。

2.3CgATPase 01基因敲除突变体△CgATPase 01表型分析
2.3.1CgATPase 01基因对菌株生长、发育的影响
在PDA培养基中,于28℃自然光照条件下培
养6 d后,不同菌株菌落形态有所差异,野生型菌株的菌落近圆形、边缘整齐、
隆起,菌落中央气生菌丝颜色比外圈深,且呈墨绿色,周围呈白色,气生菌丝浓密。

突变体△CgATPase01与野生菌HBCg01相比,中心墨绿色面积更大,颜色更深,如图3-A所示。

△CgATPase01突变体(平均直径6.1cm)的生长速率明显低于
野生型(平均直径8.2 cm)(图3-B)。

基因缺失突变体△CgATPase01分生孢子形态与野生型相比没有明显的差异,但产孢量存在明显差异,野生型产孢量是突变体产孢量的3倍,如图3-C所示。

2.3.2CgATPase 01基因对菌株致病力的影响孢子悬浮液致病力测定结果表明,利用野生型HBCg01菌株接种的叶片上产生了明显病斑,而接种突变体△CgATPase 01孢子悬浮液的叶片上没有产生病斑(如图4所示),说明P型ATP酶基因CgATPase 01与橡胶树胶孢炭疽菌的致病力相关。

Ca2+转运P型ATP酶基因对菌体正常生长、细胞形态及骨架的维持起着重要作用,在一些病原真菌中影响其侵染力。

烟曲霉PmcC基因的缺失导致菌体死亡,
而其过量表达则导致菌落生长缓慢[20]。

白色念珠菌敲除Spf1基因后降低了菌体
的生长速率[21]。

玉米黑粉菌Eca1基因的失活也导致其生长缓慢、细胞变形以及稳定细胞骨架的微管变长且分布杂乱[22]。

稻瘟菌中的MgAPT2和PDE1基因被
敲除后其致病力明显减弱[23]。

在前期研究工作中,笔者利用生物信息学方法,鉴定得到了橡胶树胶孢炭疽菌的钙转运P型ATP酶家族的一个新基因CgATPase 01,该基因编码763个氨基酸残基,从起始密码子到终止密码子共长2 291 bp[17]。

本研究通过基因敲除验证了钙转运P型ATP酶基因CgATPase 01在橡胶树胶孢
炭疽菌中的重要作用,该基因缺失后菌落的颜色发生了改变,生长速度减慢,产孢量下降。

孢子悬浮液的致病力测定结果表明,CgATPase 01基因缺失突变体对橡
胶树叶片的致病力丧失。

可见,CgATPase 01基因与橡胶树胶孢炭疽菌的生长发
育和致病力均有密切关系。

2013年,Cai等[24]首次从橡胶树胶孢炭疽菌中克隆
了一个钙转运P型ATP酶基因CgATPase,并利用基因敲除技术对其进行分析,证实了该基因是橡胶树胶孢炭疽菌的一个致病基因,该基因影响菌株穿透橡胶树叶片表皮组织的能力。

虽然2个钙转运P型ATP酶基因均与橡胶树胶孢炭疽菌的致病性密切相关,但基因和编码的氨基酸序列都存在明显差异。

与Cai等[24]报道相比,虽然2个钙转运P型ATP酶基因的缺失均能引起橡胶树胶孢炭疽菌生长速度
减慢、产孢量下降,但影响程度存在明显差异。

橡胶树胶孢炭疽菌中存在多个调控菌株生长发育和致病力的钙转运P型ATP酶基因。

P型ATP酶是一个超级家族,随着研究的广泛开展,将会有越来越多的该类基因被发掘。

1996年,Fairhead等[25]在酵母基因研究中首次提出了Split-Marker Recombination法。

目前,该方法在病原菌致病机理研究中已得到广泛应用,具
有很高的敲除效率[26]。

李超萍等[27]利用该方法对橡胶树胶孢炭疽菌的CgATG8基因进行了敲除,获得了16个转化子,经PCR鉴定可知其中7个为目的转化子,阳性率较高,为43.75%,但仅随机挑选了1个目的转化子进行了Southern杂交验证,不能真实反映基因敲除的效率。

本研究中共获得了19个转化子,经PCR鉴定可知其中5个为目的转化子,但Southern杂交验证后仅1个是单位点置换,为CgATPase 01基因敲除的突变体,其他4个目的转化子为双位点置换,敲除效率非常低。

在利用Split-Marker Recombination法进行基因敲除时,仅仅通过PCR验证不够准确,有些转化可能发生了多位点置换。

另外,基因自身的差异和同源臂的长度也都可能影响敲除效率。

本研究为进一步研究该类基因在胶孢炭疽病菌生理代谢及致病过程中的作用机制奠定了基础。

下一步将构建互补载体,对敲除突变体的缺失基因进行互补,进一步验证目的基因的功能。

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