发育生物学-水生所

发育生物学考试答卷
一、论述题
1、试述在受精过程中防止多精受精的两种主要机制及其观察实验的经典方法.
答：卵细胞受精过程中为阻止多精受精主要有两种机制：1、通过卵细胞的膜电位变化快速的阻止精子进入卵细胞；2、是通过皮层颗粒胞吐反应分泌颗粒内容物，使膜硬化，形成受精膜持久阻止精子进入卵中。

1、卵膜电位快速变化。

以海胆为例，海胆卵在海水中细胞外具有特别高的Na+浓度，细胞质的游离钠离子则相对较少，K+则在细胞中含量很高，细胞膜不断阻止钠离子内流以及钾离子外流，由于卵细胞膜上的离子浓度存在差异，采用微电极技术检测静止膜电位为-70mV，当第一个精子结合后1-3s钠离子内流，使膜电位开始向正值转换，此时检测膜电位变化为+20mV，由于精子可以与静息电位-70mV的融合，但不能与静息电位为+20mV的卵细胞膜融合，从而阻止多个精子入卵，阻止第二次受精。

2、海胆的皮层反应：
膜电位变化阻止多精受精仅仅只会持续1分钟，不足以完全阻止多精入卵，之后的阻断则由皮层完成。

皮层由皮层颗粒组成，通常分布在没有微绒毛结构的卵质膜下方，当第一个精子与卵子发生质膜融合时，质膜融合处的卵子皮层颗粒与卵子发生质膜融合，并在该处钙离子浓度升高，胞吐作用发生，皮层颗粒破裂，颗粒物质蛋白酶、粘多糖以及过氧化氢酶、透明素等释放到卵周隙，裂解卵黄膜蛋白和细胞膜之间的连接蛋白并去除结合素受体及其结合的精子形成受精膜并使其硬化，阻止多精入卵。

此时，卵黄膜改称受精膜，其它精子再也不能穿过卵黄膜。

受精膜在精子进入卵开始形成，并逐渐伸展延伸至整个卵细胞周围。

2、简述DMRT1基因家族成员在哺乳、鸟类、两栖类以及鱼类性别决定和分化中的作用。

并以该家族为例说明性别决定和分化相关基因的进化特点。

答：性别决定是一个可塑性的发育过程，主要分为环境性别决定以及遗传性别决定，遗传性别决定一般由性染色体中一系列性别决定基因启动一些性别相关基因，进一步诱导精卵巢形成。

但是，性别决定基因在不同物种中并不稳定。

Dmrt1是含DM结构域的转录因子，在进化上相对保守的因子，参与首个性别决定以及精巢分化。

在哺乳动物中，由于存在性别决定基因sry，dmrt1受sry调控参与
雄性发育的级联信号通路，对性别决定以及分化也起到重要作用。

在小鼠中dmrt1的缺失会导致卵巢特异性基因表达增加促使塞托利细胞向颗粒细胞转化，说明其是睾丸分化所必须基因，在哺乳动物出生后的精巢中，DMRT1阻抑了雌性的再程序化。

在鸟类中，几乎所有鸟类的性别决定系统都为ZW型，且Z染色体保守。

1999年Nanda发现鸡的dmrt1基因特异性定位在Z染色体上，并在所有鸟类的Z染色体上都是保守的。

进一步在鸡中分析dmrt1，确定其为依赖剂量效应的鸟类性别决定候选基因，可能是dmrt1的MHM域的甲基化程度调控性别。

2010年后发现性别决定在性别激素影响之前，dmrt1则只在性腺中表达，可能在dmrt1上游还有基因调控性别，dmrt1可能受到上游基因影响其MHM的甲基化程度来调控鸟类性别。

在两栖动物中，既存在XX/XY也存在ZZ/ZW性别决定系统，大部分两栖动物的性染色体并没有明显分化。

目前仅在ZZ/ZW系统中鉴定出性别决定基因DMW（dmrt1在W染色体上的拷贝），DM 域同源性高达89%，但在c端缺少dmrt1的激活中心，可能在功能上有所不同。

实验证明Dmr1与DMW 存在性腺表达差异，进一步研究发现，DMW的导入会使ZZ个体出现雌性，dmrt1导入会使ZW出现精巢特征，推测二者高度相似的序列使其在性别决定早期间DMW与dmrt1存在竞争靶点，阻止dmrt1发挥作用。

鱼类是脊椎动物中性别决定方式最多的类群，多样化的性别决定使其成为理想的研究性别决定的模型。

早在1921年明确青鳉为XX/XY型性别决定系统。

青鳉在染色体形态上也没有分化，2002年在Y染色体上发现一个含DM域的基因与dmrt1同源性达83%。

且在性别决定之前表达。

通过实验证明Dmy是青鳉雄性发育所必须的，于2007年证明Dmy是青鳉的性别决定基因。

研究dmy以及dmrt1发现都有一个转座子的靶点，二者可能是通过对转座子的竞争性结合从而对青鳉性别决定起作用。

青鳉dmY/dmrt1Y 是常染色体dmrt1最近复制过来的，是非常新的基因。

2、性别决定和分化相关基因的进化特点：
在哺乳动物中，由于存在sry性别决定基因，Dmrt1仅仅起到睾丸发育必须，在鸟类中，dmrt 则作为性别决定候选基因存在，可能存在性别主控基因影响dmrt1。

在两栖以及鱼中，dmrt1演化成一些两栖类的性别决定基因，在性别分化过程中起着至关重要的作用。

由此可见，在进化上这些性别相关基因具有不稳定性、多样性、可变性、功能不保守性等特点。

3、简述鱼类细胞核移植和和细胞干细胞研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义
1、鱼类细胞核移植研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义
细胞核移植是指将一个二倍体细胞核移入另一个去核或不去核的未受精卵中，在一定条件下，像
受精卵一样分裂分化以及发育成幼体甚至成体的技术。

细胞移植技术有本世纪30年代发展起来，用于研究发育过程中细胞核与细胞质功能及其二者互作关系，探索遗传发育和细胞分化等一些理论问题，后来被发现可培育出新的品种。

鱼类因产卵多，卵体积大及体外受精和发育等优点，是研究细胞核移植的极好材料。

1938年德国著名科学家Spemann提出核移植设想，于1952年Briggs和King在两栖蛙类中获得成功。

60年代初，我国实验胚胎学家童第周先生首先将核移植用于硬骨鱼类，研究核质发育。

后来，童第周又对不同科之间的鱼类进行核移植，发现细胞质和细胞核对信息遗传的表达都有影响。

杂种鱼的诞生以及饲养到性成熟，证明细胞核移植方法获得远源杂种鱼是培养具有重要经济价值的鱼类新品种的有效途径。

1980～1984年, 陈宏溪等连续核移植将短期培养的鲫鱼和金鱼肾细胞的细胞核移植入鲫鱼去核卵中，结果鲫鱼之间的核移植获得了核质杂种鱼，并成功得到肾细胞的核移植的性成熟成鱼。

表明经过培养的分化了的成鱼体细胞核已恢复分裂能力。

1990年，张念慈等人进行青鱼和草鱼的体外属间移植实验，以经过16次传代培养的草鱼胚胎细胞为供体, 青鱼成熟未受精孵作受体, 获得发育至原肠期胚胎4个, 发育至尾芽期胚胎3个, 心跳期胚胎1个。

又以经过15代培养的青鱼囊胚细胞作供体, 团头鲂未受精孵作受体, 获得发育至体节出现期胚胎6个；2001年，胡炜在斑马鱼模式动物与红鲤、泥鳅、金鱼以及稀有鮈鲫之间进行异种细胞核移植，从而讨论鱼类细胞核移植在程序化机制，他发现，连续核移植技术可以显著提高鱼类异种体细胞移植胚的发育率；卵细胞质对细胞核在程序化作用与供体细胞核所处的细胞周期密切相关，推测体细胞再程序化以及重构胚发育阻滞的机制与mtDNA与核基因间的相互作用紊乱导致DNA损伤细胞凋亡等有关。

2002年，青岛海洋大学李莉将斑马鱼头肾细胞和尾鳍细胞经培养后移入同种鱼的去核卵中并获得了发育至尾芽期和肌肉感应期的胚胎。

在鱼类中展开细胞核移植的研究不仅仅是利用鱼类优势研究胚胎发育过程中细胞核和细胞质的功能，也是为了获得优良性状的核质杂种鱼。

中国的水产养殖广泛，鱼类已经作为常见餐桌的食物，从中摄取的优质蛋白有益于我们人类身体健康，而具有生长优势以及高营养价值的核质杂种鱼是一个很有应用价值以及推广前景的优良鱼类，细胞核移植已经成为鱼类鱼中的重要方法。

除此之外，鱼类细胞核移植技术可用于研究细胞核发育潜能，多倍体纯合、二倍体的育种等，可以利用这一技术系统来研究鱼类外源染色体对发育的影响以及探索改良品种的可能性。

核移植技术在鱼类育种上发挥重大的作用。

2、细胞干细胞研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义
胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期发育胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离得到的一种未分化的永久性细胞系。

这种细胞一方面保留了所有的发育潜力，在适合的条件下，能够分化成多种类型的细
胞和组织，将ES细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主胚胎各种组织的构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，遗传给后代；另一方面，人们可以对ES细胞的基因组进行各种遗传操作，包括随机引入外源基因到ES细胞基因组中，或通过同源重组，定点引入外源基因到ES细胞基因组中或破坏基因组中某一特定的靶基因；通过细胞移植或核移植技术生产嵌合体或转基因动物又可以将细胞水平的定点突变转变为个体水平的定点突变。

因而ES细胞成为研究动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因功能和表达调节等发育生物学基础研究的一个非常理想的工具，也是进行动物组织工程、人类疾病防治和制作定点突变转基因动物或缺基因动物的重要手段。

ES细胞最初是从小鼠中分离出来的。

1981年，Evans和Kaufman及Martin分别建立了小鼠ES细胞系，这一开创性成果成为胚胎干细胞研究领域的里程碑。

随后，ES细胞培养的研究在哺乳动物上蓬勃开展起。

但在低等脊椎动物中的ES细胞研究甚少。

在鱼类ES细胞培养方面，迄今主要以小型实验性鱼类为材料开展了一些研究工作。

斑马鱼和青鳉由于个体小传代周期短，全年繁殖等优点是研究鱼类干细胞培养的首选材料。

最早在鱼类中尝试干细胞分离的工作者是1992年collodi等人在斑马鱼中进行的。

他们借鉴小鼠ES细胞培养方法从5-8日龄的斑马鱼中分离出成纤维细胞，经传代培养后，获得成纤维细胞系（可维持6个月），后用丝裂霉素C处理可被用作滋养层细胞。

后来又从早期斑马鱼胚胎中分离单个细胞培养，成功培育出ES细胞。

1994年，Wakamats等同样借鉴小鼠ES细胞培养方法成功建立了青鳉ES细胞；Hong和Schartl于1996年采用不同于小鼠的ES细胞培养方式，无滋层技术成功建立青鳉ES细胞系，该细胞系可以进行长期冷冻保存，解冻复苏后又能正常生长，与其他干细胞类似。

2002年Chen S L等采用无滋养层培养技术成功建立了海水养殖鱼类花鲈和真鲷的胚胎干细胞系。

经不同人员验证下发现这些干细胞系在不同的诱导因素下可分化出不同的细胞，表明这些鱼类ES细胞具有体外分化能力。

鱼类ES细胞为建立基因打靶技术奠定的基础，二者结合开辟了鱼类基因转移研究的新突进，也为鱼类功能基因组研究提供平台。

此外，胚胎干细胞是尚未分化的全能性细胞，在胚胎干细胞内必然有一些基因负责维持胚胎干细胞的全能性，防止其分化，通过比较鱼类胚胎干细胞和已分化细胞的基因表达差异，有可能筛选出调控鱼类细胞发育和分化的功能基因，查明鱼类细胞分化的分子机理。

胚胎干细胞是全能性细胞，保留着发育的全能性，通过细胞核移植可以较容易发育为鱼苗。

胚胎干细胞核移植的成功率较成年体细胞核移植要高许多。

因此，建立优良、珍稀鱼类的胚胎干细胞冷冻库，即可将这些鱼类的遗传资源长期保存起来，需要时，借助于细胞核移植技术，培育出核移鱼苗，即可恢复所需要的鱼类物种，因此，胚胎干细胞技术在鱼类种质保存和遗传多样性保护上也具有重要意义和应用潜力，这方面的研究值得探索。

4、20世纪发育生学24个里程碑的研究成就之一为例，结合自己将要研究的方向，试谈其科学意义以及对自己研究工作的借鉴和指导作用。

美国《科学》杂志公布的2015年十大科学突破，被业内誉为“基因剪刀”的CRISPR基因组编辑技术当选今年头号突破。

认为这是一个“前所未有的选择”，因为这项技术过去两次入选《科学》年度十大突破，今年“晋升”到头号突破。

CRISPR全名为“成簇的、规律间隔的短回文重复序列”，是细菌防御病毒入侵的一种机制，2012年才被科学家发现并加以利用，成为生物医学史上第一种可高效、精确、程序化地修改细胞基因组包括人类基因组的工具。

由于CRISPR有着精确、成本低及操作简便等特点，许多科研机构都开始开发利用这项技术。

本实验室主要研究鱼类生殖方面，CRISPR基因编辑技术的出现，是广大基因工作者的福音，现阶段的实验室研究已经离不开基因编辑技术，对于某物种某基因的功能研究容易想到的便是基因敲除，观察其表型，研究其功能，探索基因在个体中的机制。

本人现所做工作关于cas9以及gRNA的应用方面，利用CRISPR-cas9和gRNA的基因打靶功能。

以斑马鱼为研究对象，控制鱼类育性，探索一条实现杂交子代100%不育的技术路线。

随着基因编辑技术的不断发展，其用途也越来越广泛。

在基因功能的研究、基因治疗、构建模式生物、改造和培育新品种等方面发挥重要的功能。

尽管基因编辑技术目前还存在着种种不足，但随着分子生物学的不断发展及新的实验方法的不断涌现，在未来的发展中，基因编辑技术必将成为生命科学和生物医学等领域研究与应用的重要工具。