重组水蛭素的原核表达及分离纯化

水 蛭 素 蛋 白表 达 效 率 最 高 ，占菌 体 总 蛋 白 ７２．７ ，显 著 高 于单 因 子 变 量法 优 化 结 果 （Ｐ＜ Ｏ．０５）。 进 一 步 分 析 发 现 ，
各 影 响 因素 之 间存 在 明显 的交 互 效 应 ，影 响 了单 因素 试 验 结 果 的准 确 性 。通 过 亲 和 层 析 纯 化 后 的重 组 水 蛭 素 纯 度
中 图分 类 号 ：Ｑ７８
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７１—７２３６（２Ｏ１８）０１—０００１—１３
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ Ｈ ｉｒｕｄｉｎ
ＨＵ ＡＮＧ Ｋｏｎｇｗｅｉ，ＬＩ Ｚｈｉｐｅｎｇ，ＣＵＩ Ｋｕｉｑｉｎｇ，ＳＨ Ｉ Ｄｅｓｈｕｎ，ＬＩＵ Ｑｉｎｇｙｏｕ （Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｏ－ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，
Ｄｓｏｏ 值为 ０．４时 ，加入 Ｉ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ，３７℃下诱导 ７ ｈ，重组水蛭素蛋 白表达效 率最 高，占菌体总蛋 白 ６６．５％；
而 ＤＯＥ试 验 优 化 结 果 为 ：在 菌 体 密 度 Ｄｅ。。 值 为 ０．６时 ，加 入 ０．８２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ，３１．９℃ 下 诱 导 ７．６ ｈ，预 测 重 组
中 国畜 牧兽 医 ２０１８，４５（１）：１ １３ Ｃｈｉｎａ Ａ ｎｉｍａｌ Ｈ ｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ
ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７Βιβλιοθήκη —７２３６．２０１８．０１．００１
重 组水 蛭 素 的原 核 表 达 及 分 离 纯化
黄 孔 威 ，李 志 鹏 ，崔 奎 青 ，石 德 顺 ，刘 庆 友
Ｈｉｓ—Ｔｒａｐ亲 和 层 析 对 重 组 蛋 白进 行 纯 化 ，并 通 过 凝 血 酶滴 定 法 对 重 组 水 蛭 素 的 活 性 进 行 测 定 。结 果 显 示 ，试 验 成 功构 建重 组水 蛭 素 原 核 表 达 载 体 ，水 蛭 素 蛋 白 为 可 溶 性 表 达 。 单 因 素 变 量 优 化 后 的 诱 导 条 件 为 ：在 菌 体 密 度
重 组 水 蛭 素原 核 表 达 系 统 ，并 对 Ｄｅ。。 值 、诱 导 时 问 、诱 导 剂 ＩＰＴＧ 浓 度 和 诱 导 温 度 ４种 诱 导 条件 进 行 了探 索 ，同时
通 过 引入 试 验 设 计 （ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＤＯＥ）方 案 将 ４种 因 素 对 诱 导 效 率 的影 响 进 行 进 一 步 系 统 的 优 化 ，使 用
ｂｅｓｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｄｄｉｔｉｏｎ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ａｔ Ｄ６０ｏ 一０．４ ａｎｄ ３７℃ ｆｏｒ ７ ｈ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ６６．５％
Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍ ｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｉｒｕｄｉｎ ｔｏ ｍ ｅｅｔ ｔｈｅ ｄｅｍ ａｎｄ ｏｆ ｍ ｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ｈｉｒｕｄｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｏｐｔｉｍ ｉ－ ｚｉｎｇ ｃｏｄｏｎ ｏｆ ｈｉｒｕｄｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｄ６ｏｏ ｖａｌｕｅ， ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍ ｅ，ｉｎｄｕｃｅｒ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍ ｐｅｒａｔｕｒｅ ｗ ｅｒｅ ｏｐｔｉｍ ｉｚｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ＤＯ Ｅ ｅｘｐｅｒ— ｉｍ ｅｎｔａｌ ｓｃｈｅｍ ｅ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔ ｈｅ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｈ ｉｓ——Ｔｒａｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｉｒｕｄｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｒ—— ｍ ｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｏｍ ｂｉｎ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ ｈｉｒｕｄｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｒｕｄｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｏｌｕｂｌｅ． Ｔｈｅ
可 达 ９９ ，抗 凝 活 性 为 １１４ ＡＴＵ／ｍｇ。研 究 成 功 构建 了 重 组水 蛭 素 原 核 表 达 载 体 ，对 其 表 达 条 件 进 行 了优 化 ，并 获
得 了重 组 水 蛭 素 蛋 白 ，为 水 蛭 素 应 用 于 生 物 医 药 奠 定 了基 础 。
关 键 词 ：水 蛭 素 ；原 核 表 达 ；诱 导 条 件 优 化 ；Ｄ０Ｅ；亲 和 层 析
（广 西 大 学 ，亚 热 带农 业 生 物 资 源 保 护 与 利 用 国 家 重 点 实 验 室 ，南 宁 ５３０００４）
摘 要 ：为 了 提 高水 蛭 素 的 生 产 效 率 以 适 应 生 物 医 药 应 用 的 需 求 ，试 验 通 过 对 水 蛭 素 基 因进 行 密 码 子 优 化 ，构 建 了