核酸的分离提取及纯化
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2.5 核酸的保存
(1) 对DNA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2)
对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2) 或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。 Home
第二节 核酸的分离纯化
主要内容
前言 1
1.1
核酸分离、纯化原则
保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2
2.1 2.2 2.3 2.4
分离提取核酸的主要步骤
细胞的破碎 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸的沉淀 核酸的浓度测定
2.5
核酸的保存
前 言
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及 盐存在。
2.4.2
溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量 的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
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核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中， 核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还
具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。ห้องสมุดไป่ตู้
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
(2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制 剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ）
①改变核酸的溶解缓冲液；
②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
2.3.1
核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶课剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
(6)
生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2
核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
注：
可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为
1.8的情况。
B：测RNA
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之 间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤
a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后， 转入分光光度计的石英比色杯中。 b．分光光度计先用一定量的水校正零点。
c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。
d．计算浓度。 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×40/1000。 e．分析纯度。
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2.4
核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2) 10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易 挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇
（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
测定结果分析
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。
1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和 小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid)
（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）
（6）氧钒核糖核苷复合物 (VanadylRibonucleoside Complex, VRC)
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2.1 细胞的破碎
(1) (2) (3) (4) (5) 高速组织捣碎机捣碎 玻璃匀浆器匀浆 超声波处理法 液氮研磨法 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）
作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中；
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
2.5 核酸的保存
(1) 对DNA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2)
对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2) 或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。 Home
第二节 核酸的分离纯化
主要内容
前言 1
1.1
核酸分离、纯化原则
保持核酸分子一级结构的完整性
1.2. 防止核酸的生物降解
2
2.1 2.2 2.3 2.4
分离提取核酸的主要步骤
细胞的破碎 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸的沉淀 核酸的浓度测定
2.5
核酸的保存
前 言
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及 盐存在。
2.4.2
溴乙锭荧光法测定核酸的含 量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的 DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量 的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
1.2.1 DNA酶抑制剂
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
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核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中， 核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则：
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还
具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。ห้องสมุดไป่ตู้
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
(2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制 剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ）
①改变核酸的溶解缓冲液；
②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
2.3.1
核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶课剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
(6)
生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2
核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
注：
可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为
1.8的情况。
B：测RNA
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之 间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤
a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后， 转入分光光度计的石英比色杯中。 b．分光光度计先用一定量的水校正零点。
c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。
d．计算浓度。 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×40/1000。 e．分析纯度。
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2.4
核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2) 10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易 挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇
（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
测定结果分析
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。
1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和 小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid)
（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）
（6）氧钒核糖核苷复合物 (VanadylRibonucleoside Complex, VRC)
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2.1 细胞的破碎
(1) (2) (3) (4) (5) 高速组织捣碎机捣碎 玻璃匀浆器匀浆 超声波处理法 液氮研磨法 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）
作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中；
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：