大黄对慢性肾功能不全大鼠爱惜机制的研究

大黄对慢性肾功能不全大鼠爱惜机制的研究【摘要】目的观看大黄对慢性肾功能不全大鼠肾功能及肾组织TGF-β1和smad7表达的阻碍。

方式采纳腺嘌呤法成立大鼠慢性肾功能不全模型，医治组予以大黄（4 g/kg/d）灌胃。

医治4 周后，检测各组大鼠的24 小时尿蛋白定量、肾功能，通过组织学及蛋白印记观看肾组织TGF-β1和smad7的表达。

结果医治组大鼠的24h尿蛋白定量、肾功能明显增加（P＜），而医治组大鼠24 h尿蛋白定量、肾功能较非医治组减少（P＜）。

非医治组大鼠肾组织TGF-β一、smad7表达较正常组明显增加（P＜）。

结论大黄可降低慢性肾功能不全大鼠24 小时尿蛋白、肾功能水平，抑制肾组织TGF-β1和smad7表达。

大黄对慢性肾功能不全的爱惜机制可能与降低肾脏TGF-β1和smad7表达有关。

【关键词】大黄；慢性肾功能不全；腺嘌呤；转化生长因子-β1；smad
[Abstract] Objective To study the effect of Dai Huang on glomerulosclerosis and expression of TGF-β1 and smad7 in rats with CRF. Methods Rats were divided into control group, not treated group and Dai Huang treated group with 20 rats in each group. The rats in the latter two groups were intragastric of Adenine. the treated group was fed with Dai Huang at a dose of 4g/(kg·d) for 4 weeks. Urine protein excretion, urea nitrogen and creatinine was measured. The expression of TGF-β1 and
Smad7was measured. Results Compared with the control group, the not treated group showed higher urine protein excretion, urea nitrogen, creatinine(P<and expression of TGF-β1 and smad7. Conclusion Dai Huang can diminish urine protein excretion and prevent glomerulosclerosis in subtotally nephrectomized rats. This protective effect is presumed to be associated with its effect on expression of TGF-β1 and Smad7.
[Keywords] Dai Huang; Chronic renal failure; Adenine; TGF-β1; Smad7
大黄为蓼科植物掌叶大黄，现代药理学研究发觉，大黄有抗血小板聚集、降血脂、清除氧自由基、提升超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减轻免疫炎症反映的功效，同事具有泻热通便、解毒消痈、行瘀通经功效。

咱们通过观看大黄对慢性肾功能不全大鼠的医治，观看其对尿蛋白排泄、肾功能的阻碍；并观看其对肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）、smad7的蛋白表达及肾脏病理转变的阻碍，探讨大黄对慢性肾功能不全的疗效及作用机制。

1 材料与方式
材料
湖北产中药材大黄。

腺嘌呤(产品批号2007109)。

兔抗TGF-β一、Smad7抗体；En Vision免疫组化试剂盒；BCA试剂盒。

实验动物分组和模型成立
雄性SD大鼠60 只，7 周龄，体重190±20 g。

适应性饲养1 周，
随机分为正常组20 只和腺嘌呤组40只。

腺嘌呤组每日腺嘌呤300 mg/kg灌胃，6 周后以代谢笼留取24 小时尿液，眶内静脉采血，测定24 小时尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。

检测发觉全数造模成功。

随机分为2 组：非医治组20 只，医治组20 只。

医治组大鼠每日给予黄葵胶囊[2 g/kg·d]灌胃，同时正常组和非医治组给予等量生理盐水灌胃。

4周后全数大鼠以代谢笼留取24 小时尿液，眶内静脉采血，测定24 小时尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。

大鼠处身后取部份肾组织置于10％中性甲醛中固定，部份肾组织液氮保留用于蛋白印迹杂交方式（Western blot）检测蛋白表达。

实验期间大鼠自由饮水、进食。

检测方式
尿蛋白定量及肾功能测定
病理形态学观看
肾组织经10％中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸腊、包埋、切片，厚3 µm，行HE染色，观看肾小球硬化及肾间质纤维化的程度。

蛋白印记分析
各组取约100 mg肾组织置于1 ml裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂PMSF 100ug/ul，aprotinin 1 ug/ml，leupeptin 1 ug/ml），匀浆后冰浴30 分钟，然后4 度12000 g离心20 分钟。

提取蛋白后用BCA 法测量蛋白浓度。

取等量蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封锁液封锁，加入1：200稀释的TGF-β1抗体，4 ℃留宿。

％TBST洗膜3 次，ECL显影。

统计学处置
计量资料采纳均数±标准差表示，数据用SPSS 软件包进行统计学处置。

各组间均数比较采纳单因素方差分析，P <以为有统计学意义(方差齐时用LSD法、方差不齐时用Tamhane法)。

2 结果
尿蛋白定量转变
非医治组和医治组大鼠尿蛋白排泄明显高于正常组(P <；医治组大鼠尿蛋白定量与非医治组比较有所降低(P <，见表1。

血清生化指标转变
非医治组和医治组大鼠血肌酐明显高于正常组(P <；医治组大鼠血肌酐与非医治组比较有所降低(P <；尿素氮转变同血肌酐转变，见表1。

表1 各组大鼠尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐水平（）
组别n 尿蛋白定量(mg/d) 尿素氮(mmol/L) 肌酐（µmol/L）
正常组 20 ±±±
非医治组 20 ±* ±* ±*
医治组 20 ±*▲±*▲±*▲
*与正常组相较，P<，▲与非医治组相较，P<。

组织病理学改变
在HE染色中，非医治组大鼠可见明显的肾小球增生，系膜增殖，肾小球毛细血管部份塌陷，球囊粘连，部份肾小球完全硬化，间质有
炎细胞浸润，部份肾小管已萎缩，系膜外基质显著增加（图1）。

医治组与非医治组比较，肾小球损伤、硬化轻，肾间质炎细胞浸润少，间质纤维化。

肾组织TGF-β1和smad7用蛋白印记方式检测结果
医治组和非医治组大鼠相较TGF-β1表达下调，而smad7表达上调。

见图2。

3 讨论
慢性肾功能不满是所有肾脏疾病进展的一起结局，其实质是肾脏纤维化，严峻要挟人类健康。

目前研究说明，TGF-β1和其受体下游的信号转导因子Smad7蛋白在增进肾小球纤维化及肾小管间质纤维化方面起重要作用。

TGF-β1 是迄今已知作用最强的一种促肾纤维化的细胞因子，具有调剂细胞的增殖、分泌、迁移和凋亡等多种生物学活性。

TGF-β1在肾纤维化中的作用涉及到细胞外基(ECM)、细胞增殖及转分化、炎症浸润等各个环节，是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键细胞因子，在肾纤维化进程中TGF-β1起着关键作用[2]。

正常组非医治组医治组
图2 Western blot检测各组大鼠TGF-β1和smad7蛋白表达结果
目前以为，Smad7要紧通过与TGF-β1型受体结合抑制TGF-β1信号转导，以往在许多肾脏疾病如肾小球肾炎、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等的动物模型和人的肾活检标本的研究中，都提示
TGFβ1／Smad7信号通路被激活，用抗TGF-β1的抗体或Smad7转基因医治时，慢性肾脏病的肾脏纤维化取得改善，提示Smad7信号通路在肾脏纤维化的发生进展中起着重要作用[3]。

现代实验说明大黄能抑制TGF—β1的过度表达，减缓肾功能恶化速度，而被被普遍用于医治慢性肾小球肾炎和慢性肾衰竭[4]。

慢性肾功能不全的实质是肾脏纤维化，而TGF-β1是促肾纤维化最重要的细胞因子，smad7 蛋白是TGF-β1受体的胞内激酶底物，在调剂TGF-β1促肾纤维化进程中起重要作用，本实验结果显示大黄可能通过减少腺嘌呤致慢性肾功能不全大鼠的TGF-β1及增加smad7蛋白表达，来减缓乃至抑制肾小球及肾间质纤维化；降低大鼠24 小时尿蛋白定量、血尿素氮及血肌酐；减轻慢性肾功能不全大鼠肾病组织的病理改变，延缓慢性肾功不全进入终末期肾衰竭的时刻。

参考文献
[1] Wang W, Koka V, Lan HY. Et al. Transforming growth factor-beta and Smad signalling in kidney diseases[J]. Nephmlogy(Carlton),2005,10(1):48-56.
P2] Keith H,Jeremiah M．OP-l prevents renal fibrogenesis associated with ureteral obstruction[J].Am J Phy Ren Phy. 2000,280(3):130-136.
[3] Hirotaka Yamamoto. Treatment with anti-TGF-β1antibody ameliorates chronic progressive nephritis by inhibiting Smad／TGF-β 1 signaling[J].Kidney
International,2004,65:63-74.
[4] 张冉,许旭东. 大黄灌肠对慢性肾衰竭患者转化生长因子-β1及肾功能的阻碍[J].中国中西医结合肾病杂志,2020, 9(3):263-264.。