白菜与芜菁亚种间杂交种及其亲本莲座期基因差异表达

白菜与芜菁亚种间杂交种及其亲本莲座期基因差异表达*
吴才君1，2曹家树1†何勇1董德坤1
（1浙江大学蔬菜研究所，杭州 310029；2江西农业大学农学院，南昌 330045）
摘要：以白菜‘矮脚黄’97-3-2自交系作为母本、‘白蔓菁’001-24自交系为父本及其杂交后获得F1
代为材料，利用cDNA-AFLP技术，分析杂种与亲本在莲座期叶片的基因差异表达类型与主要产量性状的杂
种优势关系。

研究表明，基因的差异表达与杂种优势的形成有密切关系，其中双亲共沉默（ABF1）与叶片数
杂种优势呈显著正相关；杂种特异表达 (UNF1)和单亲表达沉默 (UNP)与单株重杂种优势呈显著正相关。

关键词：白菜；芜菁；杂种优势； cDNA-AFLP；基因差异表达类型
中图分类号：S634 文献标识码：A 文章编号：
白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino）与芜菁（B. campestris L. ssp. rapifera (Matzg.) Sinsk）同属十字花科芸薹属芸薹种（B. campestris L. syn. B. rapa L.），其中白菜原产于我国，芜菁也是我国古老蔬菜之一，且大白菜（B. campestris L. ssp. pekinensis Olsson）起源于它们的杂种后代，是少见的杂种优势固定的物种之一[1]。

而各自亚种内自交系间及亚种间均具有明显的杂种优势。

杂种优势是一复杂的遗传现象，影响因素较多。

围绕杂种优势形成的遗传学基础，国内外学者做了大量的理论探讨，相继提出了许多有关杂种优势的学说，例如显性假说、超显性假说、上位性作用[2]、基因组互补作用[3]、基因多态性、基因网络系统[4]、杂合酶协同效应[5]]等。

两个基因型不同的亲本杂交，F1代产生杂种优势，显然同亲本基因在杂种遗传背景下的表达调控有关。

Romagnoli等[6]和 Tsaftsris等[7]从基因表达水平上进行研究发现，与亲本相比，杂交种的mRNA含量和种类均发生了变化。

Xiong等 [8]以水稻为材料，对叶片的基因差异表达与杂种优势分析后认为：杂种优势与亲本基因在杂种中抑制表达有关。

Sun等 [9]和倪中福等 [10]对种间和品种间小麦杂交种和亲本的分析认为，超亲表达基因可能在小麦杂种优势形成中起重要作用。

吴利民等 [11]的研究认为小麦家族基因的双亲沉默表达与杂种优势呈显著负相关。

吴敏生等 [12]利用*受高等学校博士学科点专项科研基金（20030335117）和浙江省重大科技项目（计划编号：021102536）资助
†通讯作者，Anthor for correspondence, E-mail: jshcao@
cDNA-AFLP技术对玉米的2个杂交种及其自交系基因差异表达进行了比较，认为玉米杂种优势的大小可能与双亲基因间的抑制有关。

但是，以上研究主要集中在粮食作物上。

本研究以‘矮脚黄’白菜自交系（97-3-2）和‘白蔓菁’芜菁自交系（001-24）及其组配的杂交种为材料，运用cDNA-AFLP技术，研究莲座期亚种间杂交种与亲本叶片的基因差异表达类型与主要产量性状杂种优势的相关性，为探讨白菜、大白菜与芜菁等物种间杂种优势的形成机理提供依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料
以‘矮脚黄’白菜自交系（97-3-2）作为母本、‘白蔓菁’芜菁自交系（001-24）为父本及其杂交后获得F1代为材料，2002年9月播于苗床，10月移栽于试验田，按照完全随机区组设计，3个重复，田间管理按常规进行。

莲座期，取叶备用，并对取样调查的植株编号挂牌。

TRIzol®购自Life Technologies公司。

Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司。

cDNA合成试剂盒SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit购自Clontech公司。

EDTA、DEPC、Acrylamide、Bis-adrylamide、尿素、过硫酸铵、TEMED等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

cDNA-AFLP所用接头和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列如下：TaqⅠ接头：5`-GACGATGAGTCCTGAC-3`；5`-CGGTCAGGACTCAT-3`；
TaqⅠ预扩增引物：5`-GACGATGAGTCCTGACCGA-3`；
TaqⅠ选择性扩增引物：5`-GATGAGTCCAGACCGANN-3`（N代表ATCG中任意一种，T4 ~ T19共16条引物）；
AseⅠ接头：5`-GCGTAGACTGCGTACC-3`；5`-TAGGTACGCAGTC-3`；
AseⅠ预扩增引物：5`-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3`；
AseⅠ选择性扩增引物：5`-GACTGCGTACCTAATNN-3`( A4 ~ A19共16条引物)。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成
分别取亲本和杂交种莲座期的叶片为材料，用TRIzol抽提总RNA，具体操作方法参照TRIzol®产品手册。

cDNA第一链和第二链的合成参照SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit User Manual 方法进行。

1.3 cDNA-AFLP方法
参照http://www.dpw.wau.nl/pv/index.htm 上的cDNA-AFLP Procotol进行。

电泳采用6%的聚
丙烯酰胺凝胶电泳，1×TBE电泳缓冲液，1700V电压电泳至二甲苯青距下部边沿10cm处停止电泳并银染检测。

1.4 统计分析
在莲座期观测亲本和F1在田间生长的性状（随机测取50个单株）：株高（植株基部与地面接触处至植株叶片最高处的自然高度）、株幅（植株外叶开展最宽处，包括纵横两个垂直方向）、叶幅（最大叶片的长与宽，长度量至叶翼基部）、叶数、单株重，并进行统计分析。

杂种优势采用中亲优势，通过下列公式计算H＝F1－(P1＋P 2)／2（H表示杂种优势值，F1表示杂种所测的性状值，P1和P2表示所测的亲本性状值）。

统计2次重复扩增中稳定存在的条带。

扩增条带存在时记录为1，否则为0。

根据同一cDNA片段在两个亲本和杂种F1中出现与否分成4种类型，将每种差异表达类型的数量作为变量，与产量性状的杂种表现（F1性状平均值）和杂种优势进行相关性分析，相关系数在Microsoft Excel软件中计算。

2 结果与分析
2.1 白菜与芜菁亚种间杂交亲本与杂种产量构成性状的杂种优势
白菜、芜菁莲座期的亲本与F1代，在株高、株幅、叶幅、叶数、单株重上存在较大的差异。

在这些产量构成性状中，单株重显示出最高的杂种优势，株高、叶数、株幅、叶幅亦显示出较高的杂种优势（表1）。

表1白菜与芜菁亚种间杂交亲本与杂种产量构成性状的杂种优势
Table 1 Midparent heterosis of yield component traits in rosette leaves stages of Chinese cabbage-pak-choi, turnip and their hybrids
项目
Item
株高(cm)
Height of plant
株幅(cm×cm)
Breadth of plant
叶幅(cm×cm)
Breadth of leaf
叶数(片)
Leaf No.
单株重(kg)
Weight of plant
97-3-2 24 34×39
22×15 15 0.19 001-24 32 42×40
35×16 10 0.28 F1 41
46×52
47×17
17
0.42 杂种优势 Heterosis 13 8×12.5
18.5×1.5 4.5 0.185
百分率％ Percent 46.4 36 78.7 2.2 白菜与芜菁亚种间杂交种和亲本间基因表达差异
利用256对引物组合对莲座期的白菜与芜菁亚种间杂交种及其亲本进行cDNA-AFLP分析，
共计扩增出14872条带，其中2次PCR扩增中稳定存在的带平均数为13215条，可重复率为88.86％。

在这稳定存在的13215条带中有2460.6条表现出多态性，差异表达比例为18.62％。

杂种和亲本间差异表达的条带可分为4种类型（图1）：（1）杂种特异表达类型(UNF1)，即该条带仅在杂种中出现，而在双亲中均不出现；（2）双亲共沉默类型(ABF1)，即该条带在双亲都有，而杂种中没有；（3）单亲表达沉默类型(UNP)，即该条带仅出现在亲本之一，而在另一亲本和杂种中没有出现；（4）单亲表达一致类型(DMP)，即该条带在在双亲之一和杂种中出现，而在另一亲本不出现。

不同的引物组合中各种差异条带所占比例不同，但趋势大致相同：均以DMP为最高，UNF1最少。

UNF1平均为2.67％，ABF1为5.12％，UNP 为3.36％，DMP 为7.47％。

图1 白菜与芜菁杂交种与亲本间莲座期基因差异表达类型。

1、2、3泳道分别代表F1、母本‘97-3-2白菜’、父本‘001-24白蔓菁’；A：杂种特异表达类型；B：双亲共沉默类型；C ：单亲表达沉默类型（母本）；D：单亲表达沉默类型（父本）；E：单亲表达一致类型（偏母本和偏父本）。

Fig 1 Patterns of differential gene expression in rosette stages of Chinese cabbage-pak-choi, turnip and their hybrids. Lanes 1, 2, 3 indicate hybrid,female parent97-3-2, male parent 001-24; A: bands observed only in F1 not in parents; B: bands observed in both parents but not in F1; C: bands observed only in female parent but not in F1 and male parent; D: bands observed only in male parent but not in F1 and female parent; E: bands observed in female parent and F1 not in male parent, bands observed in male parent and F1 not in female parent.
2.3 白菜与芜菁亚种间杂交种莲座期基因差异表达类型与杂种优势的相关分析
白菜与芜菁亚种间杂交种及其亲本的4种基因差异表达类型与杂种优势的相关的cDNA-AFLP分析结果表明，基因差异表达类型与某些性状的杂种优势表现出显著相关。

其中双亲共沉默（ABF1）与叶片数杂种优势呈显著正相关；杂种特异表达（UNF1）和单亲表达沉默（UNP）与单株重杂种优势呈显著正相关（表2）。

表2 白菜与芜菁亚种间杂交种及其亲本的4种基因差异表达类型与3个产量构成性状杂种优势表现相关分析Table 2 Correlations of various patterns of differential expression in rosette stages with heterosis of 3 yield component traits in rosette stages of Chinese cabbage-pak-choi, turnip and their hybrids
基因差异表达类型patterns of differential expression
株高(cm)
Height of plant
叶数(片)
Leaf No.
单株重(kg)
Weight of plant
UNF1 -0.188
0.156
0.472*
ABF1 -0.025
0.509*
0.044
UNP -0.085
-0.088
0.510*
DMP -0.110
-0.273
-0.133 注：*为0.05水平相关显著；**为0.01水平相关显著。

Note: * and ** represent significant at 0.05 and 0.01 respectively
3 讨论
3.1杂种优势的复杂性
杂种优势的产生是一个很复杂的过程，它涉及到两个遗传背景不同的体系的相互作用。

在相
互作用过程中，双亲间基因的相互促进和抑制决定了杂交种基因表达。

杂交种相对于亲本而言，
基因表达不仅存在质的差异，还存在量的差异。

正是这两方面基因表达的变化，导致表型的变化。

通过比较本研究中基因差异表达类型所占比例与Xiong等 [8]对水稻、田曾元等 [13]对玉米、王章
奎等 [14]对小麦的分析结果，可以看到，尽管在不同作物、不同生育期、不同器官中不同差异表达
类型所占的比例不同，但至少表明，杂交种的遗传表现不是亲本遗传物质的简单相加，而是两套
基因在杂种中相互作用，引起基因表达质和量两方面的变化，进而表现出杂种优势。

所以有理由
推测基因表达的调控机制与杂种优势的形成更值得关注。

3.2 上位效应与芸薹种作物杂种优势的关系
在本研究中，基因差异表达类型与产量构成性状杂种优势的相关系数有3个达到显著水平，
即双亲共沉默（ABF1）与1个性状、杂种特异表达（UNF1）和单亲表达沉默（UNP）同与1个
性状的杂种优势呈显著正相关。

吴敏生等 [12]认为玉米杂种优势的大小可能与双亲基因间的抑制
有关。

王章奎等 [14]发现杂种特异表达与杂种优势呈显著正相关，并认为杂交种在杂合状态下能激
发某种机制，表达一些新的基因产物。

田曾元等 [13]对玉米研究发现单亲表达沉默与杂种优势关系
最密切，田增元认为对于单亲表达的基因来说，该基因在杂交种中被抑制有利于杂种优势的形成。

但笔者通过本研究的杂种优势与双亲共沉默、杂种特异表达、单亲表达沉默有关认为：这3种基
因差异表达类型都与基因相互作用有关，诸如产量、生活力之类的性状均是一系列生长、发育过程的最终产物，是许多基因共同作用的结果，这些性状与基因之间的关系有如Wright[15]所描述的“网状”结构，因此，上位性应是杂种优势的主要遗传学组分。

另外，杂种特异表达与超显性关系密切，即杂交种在杂合状态下能激发某种机制，调控参与代谢基因的各种生理生化反应，表现出杂种优势。

从以上研究结果看，杂种优势的形成可能是显性效应、超显性效应和上位效应共同作用的结果，不可能只有一种基因效应在起作用。

芜菁与白菜同属一种，而且是大白菜的祖先，大白菜在产量和品质上比芜菁与白菜更具优势。

芜菁与白菜最早可能有共同的遗传物质基础，随后适应各自不同环境条件而形成各自地理型（亚种），有了各自的适应基础，由生活标志（环境影
响）差异产生了亲缘标志（RNA）差异，从而适应各自的环境。

在良好的（正向）环境条件下，同样得到充分的表达，便有杂种优势[1]。

大白菜的杂交起源是后代杂种优势在一定条件下（农业生产水平提高）保持的表现，上位效应能说明后代杂种优势的保持问题。

因此，上位性效应是白菜杂种优势的重要遗传基础之一。

本研究结果表明，cDNA-AFLP技术是研究基因表达一种较好的方法，cDNA-AFLP由于使用严格的PCR条件和加接头，具有较高的重复性（本研究达88.86％）。

杂种优势的形成是一个多方面动态积累的过程，涉及到一系列生理代谢有关方面基因的表达调控。

基因表达具有时序表达的特征，同时也受外界环境条件(如光、温、水等)的影响。

本研究仅涉及到白菜莲座期叶的基因差异表达与产量性状杂种优势的关系，故得出的结论具有一定的局限性。

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The Relationship between Differential Gene Expression Patterns in Rosette Stages and Heterosis in Chinese cabbage-pak-choi, Turnip and Their Hybrids
Wu Caijun1,2 , Cao Jiashu1 , He Yong1 , Dong Dekun1
(1Institute of Vegetable Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 2College of Agronomy, Jiangxi Agriculture University, Nanchang 330045, China)
Abstract: With the inbred line Aijiaohuang 97-3-2 of Chinese cabbage-pak-choi(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino cv. Aijiaohuang) the inbred line Baimanjing 001-24 of turnip（B. campestris L. ssp. rapifera (Matzg.) Sinsk cv. Baimanjing） and their hybrids as experimental material, the relationship between differential gene expression patterns at rosette stages and heterosis of yield component traits in the hybrid and their parents were analyzed by using cDNA-AFLP. Four types
of differential gene expression patterns were detected between hybrid and their parents: bands observed only in F1 not in parents(UNF1); bands observed in both parents but not in F1(ABF1); bands observed only in one parent but not in F1 and another parent(UNP); bands observed in one parent and F1 not in another parent(DMP). Analysis showed that ABF1 was significantly correlated with heterosis in leaf No., UNF1 and UNP were significantly correlated with heterosis in weight of plant.These results indicated that differential expressed genes might play an important role in heterosis. Key words: Chinese cabbage-pakchoi; Turnip; Brassica campestris L. syn. Brassica rapa L.; Heterosis; cDNA-AFLP; Differential gene expression patterns。