白杨新杂种I-101×84K杨组培快繁技术研究

白杨新杂种I-101×84K杨组培快繁技术研究
杨林娜;樊军锋;高建社;周永学
【摘要】以I-101×84K杨为材料,对其组培快繁进行了研究.试验结果表明,MS为合适的基本培养基,根据正交试验结果,诱导I-101×84K杨腋芽增殖的最佳培养基MS+6-BA0.3 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1;生根培养基以1/2MS+NAA0.02 mg·L-1+蔗糖15 g·L-1+琼脂6 g·L-1为宜,生根试管苗炼苗、移栽后成活率可达90%.对试验过程中的玻璃化问题进行了初步的研究,发现大量元素浓度过高和多次继代可引起试管苗的玻璃化.
【期刊名称】《西北林学院学报》
【年(卷),期】2010(025)005
【总页数】5页(P68-72)
【关键词】I-101×84K杨;腋芽;增殖;生根;玻璃化
【作者】杨林娜;樊军锋;高建社;周永学
【作者单位】西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100;西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100;西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100;西北农林科技大学林学院,陕西,杨陵,712100
【正文语种】中文
【中图分类】S792.110.4
I-101×84K杨是西北农林科技大学林学院从连续7 a开展的白杨派种间杂交育种
材料中新近选育出来的一个优良白杨杂种。

其母本I-101杨(Populusalba)从意大利引进,父本84K杨(P.alba×P.glandulosa)从南韩引进。

I-101×84 K杨综合了父母本抗寒性强、生长快、干形通直等优良特性[1-3]。

由于该杂种系白杨起源,大田扦插成活率低[4-5],仅40%～60%左右,严重制约了该优良品种的应用推广。

本研究针对I-101×84 K杨组培快繁技术开展了深入研究,旨在为实现该优良品种的无性繁殖、规模化工厂育苗奠定基础。

1 材料与方法
1.1 采集材料和处理
2008年2月下旬,从西北农林科技大学林学院试验基地苗圃采取I-101×84 K杨1 a生苗干,进行室内水培。

当苗干上新抽生出的嫩枝长至5～10 cm时,从嫩枝上选取带1～2个芽的茎段,去叶,保留0.5 cm长的叶柄。

先用 84消毒液处理2～3 min,然后用无菌水冲洗3次,转入0.1%的HgCl2消毒5～6 min,再用无菌水冲洗5～6次,接种在不同的基本培养基上进行初代培养。

培养温度为(23±2)℃,光照时间12 h·d-1,光照强度为2 000～3 000 lx。

1.2 基本培养基筛选试验
设2个处理:以不加任何激素的MS和1/2MS为基本培养基,蔗糖30 g·L-1,琼脂
0.6%,pH 5.8,每种培养基接种20瓶,每瓶2～5个外植体,3次重复。

1.3 腋芽增殖的正交试验
以MS为基本培养基,取表面已灭菌的外植体,接种于诱导腋芽增殖的培养基上,选取6-BA、NAA、蔗糖3个因素,每个因素取3个水平,选用L9(34)正交表(表1),考察3种因素对I-101×84 K杨腋芽增殖的影响。

根据试验设计安排共设9组试验,每组接种20瓶,30 d后统计腋芽增殖率。

表1 正交试验因子与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment水平 6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)蔗糖/(g·L-1)1 0.3 0.1 25 2 0.5
0.3 30 3 1.0 0.5 35
1.4 壮苗培养
增殖后的丛生芽,往往长势较弱,并有部分幼苗出现玻璃化现象,将这些长势较弱的无菌苗放在不加任何生长调节剂的MS培养基中进行壮苗培养。

1.5 诱导生根试验
根据文献资料[4],NAA的浓度对白杨派树种的生根诱导有显著的作用,因此,在蔗糖15 g·L-1、琼脂0.6%、pH5.8为基础的1/2MS培养基上,分别添加 NAA 0 、0.01、0.02、0.05 、0.1、0.15 mg ·L-1,共6个梯度,每个梯度接种30瓶,研究NAA浓度对I-101×84 K杨生根诱导的影响。

1.6 玻璃化苗试验
对试验中出现的玻璃化苗设4个处理,以MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS为基本培养基,蔗糖30 g·L-1,琼脂0.6%,pH5.8,每种培养基接种20瓶,每瓶1个外植体,每间隔15 d继代1次,3次重复。

1.7 数据分析
应用DPS数据分析软件,对本试验中的数据进行了处理分析。

2 结果与分析
2.1 不同培养基组培苗生长的影响
在建立一项新的培养系统时,选择合适的培养基是组织培养成功的前提[6]。

本试验选取了组织培养试验中最常用的MS和1/2MS为基本培养基,观察I-101×84K杨在2种基本培养基上的生长状况。

根据试验结果(表2)可知,I-101×84K杨在MS 培养基中诱导率大于1/2MS培养基,通过Fisher精确检验,P=0.036＜0.05,说明2种培养基对I-101×84K杨诱导率的差异达显著水平。

并且MS培养基腋芽叶色浓绿、长势健壮,所以I-101×84K杨更适合在MS培养基上生长。

表2 不同培养基对腋芽生长的影响Table 2 Effects of various medium on the
growth of axillary buds培养基种类接种腋芽数/个成活腋芽数/个诱导率/% 芽生长状况1/2MS 30 17.6 58.7 淡绿,长势一般MS 30 23.8 79.3 浓绿,长势健壮
2.2 不同因子及其浓度水平对腋芽增殖的影响
按照正交试验设计,诱导出的嫩芽接种10 d左右,开始有新芽出现,随后大多数培养基中的丛生芽数量不断增加,且生长健壮。

采用新增殖出的丛生芽总数/接种腋芽总数作为腋芽的增殖率,接种30 d后统计结果(表3)。

从表3各因子水平间的极差结果表明,3种因子对腋芽增殖产生效应的大小依次是6-BA＞NAA＞蔗糖。

其中6-BA和NAA的极差值都大于空列的极差值,说明两者对试验结果的影响较大。

蔗糖的极差值小于空列的极差值,说明蔗糖浓度对I-
101×84K杨腋芽增殖影响不大。

通过进一步方差分析,确定各因素水平之间对腋芽增殖影响有无显著性差异(表4)。

表3 正交试验设计 L9(34)结果Table 3 Results of the arrangement of orthogonal L9(34)注:Ki代表水平i的总值;ki代表水平i的平均值处理号 6-
BA/(mg·L-1)A NAA/(mg·L-1)B空白试验C蔗糖/(g·L-1)D增殖率/%1 1(0.3)
1(0.1) 1 1(25) 487 2 1(0.3) 2(0.3) 2 2(30) 691 3 1(0.3) 3(0.5) 3 3(35) 446 4
2(0.5) 1(0.1) 2 3(35) 414 5 2(0.5) 2(0.3) 3 1(25) 603 6 2(0.5) 3(0.5) 1 2(30) 504 7 3(1.0) 1(0.1) 3 2(30) 124 8 3(1.0) 2(0.3) 1 3(35) 246 9 3(1.0) 3(0.5) 2
1(25) 185 K1 132.3 238.2 180.7 180.5 K2 252.1 187.8 178.7 200.5 K3 187.4 145.8 212.4 190.8 k1 44.1 79.4 60.2 60.2 k2 84.0 62.6 59.6 66.8 k3 62.5 48.6 70.8 63.6极差(R) 39.9 30.8 11.2 6.7
表4 腋芽增殖率方差分析Table 4 Variable analysis of propagation from axillary buds注:*显著(a=0.05),**极显著(a=0.01)231 836.20 115 918.10 101.317 2** 19 99变异来源自由度平方和均方 F值 F0.05 F0.01 A 2 B 249 038.89 24 519.44 21.431 0* 19 99 C 2 2 288.22 1 144.11 D 28 429.56 4
214.78 3.683 9误差 2 2 288.22 1 144.11总变异 10 291 592.90
方差分析结果表明,不同6-BA浓度对I-101×84K杨腋芽增殖诱导的影响达到极显著水平(P＜0.01),不同浓度的NAA对I-101×84K杨腋芽增殖诱导的影响也达到显著水平(P＜0.05),而不同浓度的蔗糖对I-101×84K杨腋芽增殖诱导的影响则无显著差异。

说明不同浓度的6-BA和不同浓度的NAA对I-101×84K杨腋芽增殖诱导的作用显著,蔗糖对腋芽增殖诱导影响不显著,这与直观分析的结果相一致。

为了进一步确定诱导I-101×84K杨腋芽增殖的最佳浓度以及最佳组合,对6-BA和NAA的不同水平进行多重比较(表5)。

表5 6-BA和NAA处理的多重比较结果Table 5 Results of multicomparison of 6-BA and NAA treatments注:均值分别为6-BA和NAA相同浓度水平下的各增殖率的平均值因子水平均值 5%显著水平 1%极显著水平6-BA/(mg·L-1)1 541.333 3 a A 2 507.000 0 a A 3 185.000 0 b B NAA/(mg·L-1)2 513.333 3 a A 3 378.333 3 b A 1 341.666 7 b A
从不同浓度6-BA对I-101×84K杨腋芽增殖诱导率的多重比较结果可以看出,当6-BA浓度为0.3 mg·L-1时,腋芽增殖诱导率最大,达到541.3%,而浓度为1.0 mg·L-1时,其增殖率最小,仅为185%,而且两者之间差异达到极显著水平。

说明浓度为0.3 mg·L-1的6-BA诱导腋芽增殖作用最为显著,可作为腋芽增殖诱导的最佳浓度。

从NAA不同浓度对腋芽增殖影响的多重比较结果可以看出,当NAA浓度在0.3 mg·L-1水平时,对腋芽诱导增殖率最高,大于0.5和0.1浓度水平对腋芽诱导增殖率,并且它们之间的差异已达到了5%的显著水平。

说明NAA质量浓度为0.3 mg·L-1时对腋芽增殖的效果最好,可作为最佳浓度。

由于蔗糖对腋芽增殖的效果影响不显著,一般选取平均增殖率最大时的那个浓度作为最佳浓度,即30 g·L-1作为腋芽增殖时的蔗糖浓度。

根据以上分析可知,I-101×84K杨腋芽增殖的最佳组合为6-BA0.3 mg·L-
1+NAA0.3 mg·L-1+蔗糖3 0 g·L-1,而这个组合正好也在正交试验中出现。

试验
结果可以发现,这一组合的诱导增殖率为691%是所有组合中增殖率最大的,说明分
析结果与试验结果相符。

2.3 不同浓度NAA对生根诱导的影响
腋芽增殖15 d左右,从中选取生长旺盛、幼嫩、高3 cm以上的无根试管苗为材料,进行生根诱导(表6)。

表6 NAA对生根诱导的影响Table 6 Effects of NAA on root
inductionNAA/(mg·L-1) 生根率/% 平均生根数/个平均根长/cm 根生长状况
0.00 75 5.0 2.3 根分布不规则,长势细弱0.01 89 6.2 2.6 根呈放射状均匀分布,长
势较健壮0.02 96 7.4 2.8 根呈放射状均匀分布,长势健壮0.05 94 5.5 1.9 根偏向
一侧生长,长势较好0.10 90 4.6 1.3 根偏向一侧生长,长势较好0.15 83 4.2 0.8 根
过于短粗,长势一般
从表6看出,在无任何激素的对照培养基上,随着NAA的加入,生根率逐渐增加。

当NAA浓度为0.02 mg·L-1时,生根率最高,并且根的各个生长指标最好、根系健壮。

但是当 NAA的浓度超过0.02 mg·L-1时,生根率逐渐开始下降,并且平均生根数和
根长也都呈下降趋势。

因此,诱导I-101×84K杨生根培养的最佳NAA浓度为0.02 mg·L-1,这与林静芳[4]等在白杨派树种组织培养研究中的结论相似。

2.4 炼苗与移栽
当根长达到1.2 cm左右时,打开封口膜,进行组培室瓶内炼苗,7 d左右用镊子将试
管苗从三角瓶中轻轻取出,冲洗掉粘附在根部的培养基,注意不要伤及幼苗,移入营养土中(营养土配方为:泥炭土∶蛭石∶细河沙=1∶1∶1)。

移入时使苗根自然舒展,浇
入适量水分,湿度保持在80%～90%左右,置于常温室内炼苗。

经过2 0 d左右的炼苗,成活率可达90%,叶色深绿,叶片增大,并有新叶长出,苗木长势健壮,此时可移栽大田。

2.5 引起组培苗玻璃化的原因
在组织培养中,试管苗常常会出现玻璃化现象,主要表现为叶色浓绿、叶片皱缩、茎
短而粗,植株呈水渍状。

试管苗玻璃化后在延长培养期间有可能恢复正常,但恢复正
常的比例很低,且玻璃苗的分化能力低下,难以增殖生根成苗[7-9]。

因此,笔者采用不同的培养基种类对I-101×84K杨组培苗在试验过程中出现玻璃化现象进行了探讨(表7)。

表7 培养基与继代次数对玻璃化苗的影响Table 7 Effects of medium and subculture on plantlet vitrification培养基种类接种数/个继代时间/d 腋芽生长状况继代次数与玻璃化苗情况/%1次 2次 3次 4次MS 30 15 叶色浓绿,呈水渍状48 83 94 100 1/2MS 30 15 叶色翠绿,生长健壮 0 5.6 14.2 16.1 1/3MS 30 15 叶色偏黄,生长缓慢 0 3.8 9.3 12.5 1/4MS 30 15 叶色很黄,生长很慢 0 2.4 6.7 9.4
从表7可以看出,MS培养基中出现了严重的玻璃化现象,而用1/2MS培养基时,腋
芽叶色翠绿、生长健壮,说明引起玻璃化的原因主要可能是由于培养基内的大量元
素浓度过高,尤其可能是NH+4浓度过高所致。

在对其他树种的研究中,有学者亦提出培养基中NH+4过多容易导致玻璃化的观点[10-11]。

通过本试验研究表明,在
其他条件均相同时,培养基内大量元素过多可能引起玻璃化。

初次继代培养只有
MS培养基内的腋芽48%转化为玻璃化苗,其他培养基的腋芽均未出现玻璃化现象。

然而,在蔗糖、琼脂用量和培养条件都相同的情况下,随着继代次数的增多,玻璃化的情况加重,这是白杨派无性系试管苗的普遍现象[11]。

4 结论与讨论
培养基是植物组织培养的物质基础,也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之
一[5]。

试验结果表明,MS培养基可作为I-101×84K杨组织培养的合适基本培养基。

除了基本培养基外,激素的种类和质量浓度的搭配也是关键因素[13],通过正交试验,发现6-BA对腋芽增殖的影响极显著,NAA作用显著,获得了诱导I-101×84K杨腋
芽增殖的最佳培养基,即MS+6-BA0.3 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1,pH5.8。

I-101×84K杨的生根诱导率与NAA的浓度显著相关,当 NAA浓度为0.02 mg·L-1时,生根率为96%,且根系健壮。

因此,I-101×84K杨生根培养的最佳培养基,即
1/2MS+NAA0.02 mg·L-1+蔗糖15 g·L-1+琼脂6 g·L-1,pH5.8。

目前,国内的研究者对于玻璃化发生规律和机理至今尚无定论,还没有普遍适用的行之有效的防止玻璃化发生的技术措施[14-15],所以如何控制和克服I-101×84K杨的玻璃化问题仍需做进一步的探讨。

图1 组培苗的增殖Fig.1 Proliferation of plantlets
图2 组培苗的生根Fig.2 Rooting of plantlets
图3 组培苗的移栽Fig.3 Transplantation of plantlets
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