复方丹参注射液对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用

复方丹参注射液对氧化损伤血管内皮细胞的
保护作用
作者：任香善，宋京郁，林贞花，任香玉，高英兰，金贤国
［摘要］［目的］探讨复方丹参注射液对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制. ［方法］用过氧化氢损伤内皮细胞，MTT法检测其存活率，分光光度法检测细胞培养上清液中的MDA含量，免疫细胞化学染色法检测细胞表面细胞间ICAM-1的表达. ［结果］血管内皮细胞受到氧化损伤后，细胞存活率明显降低，MDA含量明显增加，细胞间ICAM-1表达明显增加，而预先加入复方丹参注射液可改善上述结果. ［结论］复方丹参注射液通过其抗脂质过氧化作用，对氧化损伤的血管内皮细胞具有保护作用.
［关键词］内皮，血管;创伤和损伤;丹参;丙二醛
ABSTRACT:OBJECTIVE To explore the protective effects of the compound Danshen injection on the vascular endothelial cells （VECs）injured by oxidization and its mechanisms of anti-oxidization.METHODS By using primary culture of newborn umbilical vein endothelial cells（UVECs）in vitro，the UVECs were injured by H 2 O 2 .The viability of VECs was measured by Methyl thiazoiyl tetrazolium（MTT）assay.The contents of MDA in the suspension of cell culture were detected by spectrophotometer，and the expression of intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）
were detected by immunocytochemistry.RESULTS After VECs were injured by oxidization，cell viabilities were obviously decreased，but MDA content and the expression of ICAM-1were obviously increased.The above phenomenon could be prevented in some degree through adding the compound Danshen injection in advance.CONCLUSION The compound Danshen injection has protective effects on the injured endothelial cells induced by oxidization through the function of anti-lipid oxidization.
Key words:endothelium，vascular;wounds and injuries;red sage root;malondialdehyde
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是引发多种心脑血管疾病的直接病因，而许多研究结果表明血管内皮细胞（endothelial cell，EC）损伤又是AS发生的始动环节［1］ .本实验采用过氧化氢制作血管内皮细胞氧化损伤模型后利用复方丹参注射液进行干预，以探讨复方丹参注射液的主要成分丹参对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制.
1 材料与方法
1.1 材料复方丹参注射液（含丹参1g/mL）为上海中西药液股份有限公司产品，批号为021001;M199培养基为美国GIBCO公司产品;胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品;过氧化氢（300mL/L，AR级）为天津开发区海晶精细化工厂产品，临用前稀释，并在5min内使用;MTT 为SIGMA公司产品;MDA试剂盒由北京邦定生物技术有限公司提供;细
胞间ICAM-1多克隆抗体由武汉博士德公司提供;ABC试剂盒为美国产品.
1.2 方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养及分组参照文献［2，3］的方法略加修改进行.在无菌条件下，取健康产妇分娩后6h以内的脐带，用1g/LⅠ型胶原酶10～15mL灌注，使之充盈，置于37℃水浴中孵育15～20min;收集含有细胞的酶液，放入离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清液，往沉淀物中加入含有200g/L FBS、50U/mL肝素及终浓度为2mol/L L-谷氨酰胺的M199完全培养液5mL，充分混合制成细胞悬液，行4g/L台盼蓝染色，调整细胞数为1×10 8 个/L，以（1.5～2.0）×10 8 个/m 2 密度植入到培养瓶中，置于37℃，50mL/L 二氧化碳培养箱中培养，定期换液，待细胞生长成融合状态后进行鉴定.血管内皮细胞在相差显微镜下可见为单层，互不重叠，呈鹅卵石样排列;细胞呈多角形，边界清楚，核呈圆形或椭圆形，人第8因子相关抗原呈阳性.在96孔培养板中，每孔加入含细胞数为1×10 4 个的M199完全培养液100μL，置于37℃，50mL/L二氧化碳培养箱内，24h （细胞贴壁）后换成含50g/L胎牛血清的M199培养液继续培养24h.将培养所得EC分为正常组、丹参组及模型组.
1.2.2 分组培养及MTT法检测内皮细胞存活率向正常组内加入M199完全培养液;向丹参组内分别加入终浓度为0.125，0.250，1.250，2.500，12.500g/L的复方丹参注射液继续培养24h;模型组未予处理.向丹参组及模型组内分别加入终浓度为75μmol/L过氧化氢
刺激4h制作氧化损伤模型.向各组每孔内加入20μL MTT，置于37℃条件下孵育4h，倾去上清液，加入100μL二甲基亚砜，振荡数分钟，用全自动酶标仪（波长为490nm）测定每孔OD值.
1.2.3 MDA含量测定选用生长良好的人脐静脉内皮细胞制备细胞悬液，调整细胞数为（1～2）×10 8
个/L接种于24孔培养板内.细胞处理同，终止培养并分别收集每孔上清液1mL，置于-20℃冰箱待测，按照北京邦定生物技术有限公司所提供MDA试剂盒说明书，用分光光度计在波长为532nm处检测各组上清液的MDA含量. 1.2.4 免疫细胞化学染色检测细胞间ICAM-1 在无菌条件下制备2×10 8 个/L血管内皮细胞细胞悬液，并将其接种于12个25mL培养瓶内，细胞处理同，收集细胞，取细胞悬液均匀涂布于20mm×20mm载玻片上，使每涂片细胞数达到约1×10 4 个，室温晾干，冷丙酮固定10min.各组EC涂片的免疫细胞化学染色方法按照ABC试剂盒说明书进行.ICAM-1判定标准为光学显微镜下细胞膜或细胞浆呈棕黄色为阳性;细胞核及细胞浆均无着色为阴性.结果分别用阳性细胞数比例和深度积分评分法进行计算［4］ .1）每高倍镜视野下阳性细胞数比例:阳性细胞数得0%～5%为0分，6%～25%得1分，26%～50%得2分，高于50%得3分;2）每高倍镜视野下细胞染色深度:深棕黄色得1分，深褐色得3分，介于两者之间者得2分.用两项指标的乘积，代表各自的表达程度，每标本随机选取3个统计场，每组选取5个标本，取其平均值作为阳性表达率.阳性表达率按阳性细胞与总细胞数之比的计算公式计算.免疫细胞化学染色中以PBS代替1抗作为
阴性对照，大鼠的血管作为阳性对照.
1.2.5 统计学处理用SPSS10.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准偏差（x±SD）表示，进行方差分析.
2 结果
2.1 MTT法检测模型组经MTT法检测其OD值为0.088±0.005，正常组为0.228±0.009，可见模型组明显下降，两组间比较有显著性差异（P<0.01）;不同浓度丹参组的OD值均明显高于模型组（P<0.01），见表1.
2.2 各组细胞MDA含量由表1可见，模型组细胞培养液中MDA 含量明显高于正常组，两组间有显著性差异（P<0.01）;不同浓度丹参组MDA含量均明显低于模型组（P<0.05，P<0.01），而12.500g/L丹参组MDA含量则接近正常组. 表1 各组内皮细胞OD值及MDA含量比较*与正常组比较，P<0.01;与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01
2.3 免疫组织化学染色正常组EC胞浆和胞膜中ICAM-1呈微量表达，显色轻微或阳性细胞数少（图1）;模型组呈强阳性表达（图2）;12.500g/L丹参组EC染色结果与正常组相似（图3）.各组细胞培养液中ICAM-1的表达情况见表2.表2 各组内皮细胞中ICAM-1的表达情况
3 讨论
活性氧包括过氧化氢、单线态氧、超氧阴离子自由基及羟自由基等［5］，可修饰低密度脂蛋白生成氧化低密度脂蛋白，进而促进
AS的发展.本研究利用过氧化氢制作EC损伤模型，从生物化学、形态学及机能学等角度对EC损伤进行了研究.丹参作为活血化瘀药物具有扩张冠状动脉血管，增加血流量，抗脂质过氧化及减慢心率等作用，对缺血或损伤心肌具有促进恢复作用.复方丹参注射液中的主要成分是丹参和降香，其中丹参的主要有效成分为水溶性丹参素及脂溶性丹参酮［6］ .徐东波等［7］的研究结果表明，丹参的有效成分具有直接清除氧自由基的作用，起到抗脂质过氧化作用.本实验通过MTT 法观察了不同药物浓度的复方丹参注射液对氧化损伤EC的保护作用，结果表明各种浓度药物均对损伤 EC具有保护作用，且具有一定的浓度依赖性，即随药物浓度的增加抗氧化作用亦增强.MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度，可作为估计细胞损伤程度的指标［8］ .机体通过酶系统及非酶系统产生氧自由基，使生物膜中的不饱和脂肪酸脂质过氧化而形成脂质过氧化物.脂质过氧化作用不仅将活性氧转化成活性化学剂，而且还通过链式或链式支链反应增强活性氧的作用，因此初始的一个活性氧可导致很多脂类分解产物的生成，而其中的一些可引起细胞代谢及功能障碍，甚至导致死亡.本实验结果表明，预先加入丹参可减轻EC氧化损伤.ICAM-1是调节细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的相互结合，且起黏附作用的膜表面糖蛋白.Ross ［9］通过研究发现，AS的形成过程中当动脉内膜受到氧自由基损伤时，内皮细胞会表达更多的黏附分子.ICAM-1在静息EC上呈低水平表达，但在适当的环境下表达可快速上调［10］ .ICAM-1在EC的表达增强可使血液白细胞易与内皮细胞发生黏附，从而促进AS的发生和发展.本实
验发现，正常组EC中ICAM-1仅呈微量表达或不表达，而模型组中的表达显著增强，而丹参组的表达与正常组相似，其机制可能为丹参阻止EC被氧化损伤.综上所述，丹参主要通过抗氧化作用对氧化损伤的内皮细胞起到保护作用.
［参考文献］
［1］ Ross.The pathogenesis of ath-erosclerosis-anupclate ［J］.N Eng J Med，1986，314:488.
［2］Basavaraju SR，Jones TD.Atherosclerosis risks fromchemicals:part1―toxicological observations and mecha-nisms of atherosclerosis［J］.Arch Environ Contam Toxi-col，1998，35（1）:152.
［3］何作云.提高冠心病的防治水平，重视血管内皮功能损伤的研究［J］. 中国血液流变学杂志，2002，12（3）:161.
［4］任延平，吕卓人.哇巴因对体外培养血管内皮细胞的作用［J］. 高血压杂志，2003，11（6）:599.
［5］任德成.血管内皮细胞的氧化性损伤机理［J］. 心血管病学进展，2002，23（4）:235.
［6］金学军，姜英子，金成赞，等.反相高效液相色谱法测定丹参中丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量［J］. 延边大学医学学报，2003，26（3）:171.
［7］徐东波，张军平，张文志，等.丹参注射液对血管内皮细胞氧化损伤保护作用的实验研究［J］. 天津医科大学学报，2001，7
（1）:21.
［8］金英子，朴永泉，张红英.健脑灵对小鼠常压耐缺氧能力和组织中丙二醛含量的影响［J］. 延边大学医学学报，2005，28（1）:26.
［9］ Ross R.Atherosclerosis―an inflammatory disease［J］Am Heart J，1999，138（5）:S419.
［10］唐可京.ICAM-1和VCAM-1结构与表达调控［J］. 国外医学分子生物学分册，2002，24（3）:173.。