五种重要动物病毒快速恒温扩增检测技术的建立与应用

五种重要动物病毒快速恒温扩增检测技术的建立与应用
传染病是引起全世界畜牧业经济损失的最重要原因之一。

羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)和羊痘病毒(Capripoxvirus,Ca PV)是引起羊皮肤、粘膜疱疹和溃疡的重要病毒;而猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)及细小病毒(Porcine parvovirus virus,PPV)则是引起猪繁殖障碍的重要病毒。

快速、简单及特异性诊断在疫病防控中至关重要。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是一种简单、快速、敏感性高及特异性强的新型恒温扩增技术,能在37-42℃恒温条件下,20 min内完成检测。

本研究首次分别建立了快速检测上述五种病毒的荧光探针和侧流式免疫层析RPA检测方法,并成功地应用于田间样品检测。

具体研究结果如下:1.分别建立了快速检测ORFV(ORFV real-time RPA)、Ca PV(Ca PV real-time RPA)、PCV2(PCV2 real-time RPA)、PRV(PRV real-time RPA)及PPV(PPV real-time RPA)的荧光探针RPA方法,其灵敏度分别为100拷贝/反应、300拷贝/反应、100拷贝/反应、100拷贝/反应和300拷贝/反应,并均能特异性的检测相应的病毒。

利用上述建立的方法分别检测相应的田间样品,并与相对应的real-time q PCR比较,检出率分别为93%、94%、100%、93%及94%。

2.分别建立了快速检测ORFV(ORFV RPA LFD)、Ca PV(Ca PV RPA LFD)、PCV2(PCV2 RPA LFD)、PRV(PRV RPA LFD)及PPV(PPV RPA LFD)的侧流式免疫层析RPA方法,其灵敏度分别为80拷贝/反应、300 DNA拷贝/反应、100拷贝/反应、160拷贝/反应及400拷贝/反应,并均能特异性的检测相应的病毒。

利用上述建立的方法分别检测相应的田间样品,并与相对应的real-time q PCR比较,检出率分别为95%、97%、100%、93%及94%。

3.为了能同时检测样品中的ORFV和Ca PV,建立了ORFV和Ca PV双重荧光探针RPA方法(duplex real-time RPA),其检测ORFV和Ca PV DNA的灵敏度分别为1000拷贝/反应和1200拷贝/反应。

为了能同时检测PCV2、PRV及PPV,建立了多重荧光探针RPA(multiplx real-time RPA),其检测PCV2、PRV及PPV灵敏度分别为10000拷贝/反应、1000拷贝/反应和1200拷贝/反应。

该两种方法均具有很好的特异性。

4.将基于磁珠的核酸提取方法与RPA LFD方法联用,以适用于临床样品的现
场诊断。

研究结果表明,本文建立的RPA方法在ORFV,Ca PV,PCV2,PRV和PPV的检测上具有简单,快速,敏感性高和特异性强的特点。

该方法既可应用于实验室快速诊断,又可应用于现场诊断。

本文同时将一种简单的基于磁珠的现场核酸提取方法与RPA LFD方法联用,使RPA LFD方法真正的应用于现场检测。