MBP-protein纯化

亲和层析柱： MBPTrap HP 1 ml
样品：
大肠杆菌裂解液MBP2*-paramyosin-δ-Sal (分子
量约70 000)
样品体积： 7 ml
结合缓冲液： 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4
洗脱缓冲液： 10 mM 麦芽糖溶于结合缓冲液
放大
可在保持停留时间不变的情况下通过增加床体积 进行放大。该方法可在放大过程中保持层析的效 能。
使用的蛋白是来自大肠杆菌裂解液的具有双标签 的荧光蛋白(紫色，参见图 3D)(His)6-mCherry-Strep(II) ，该蛋白可在587 nm和 280 nm处进行检测。 纯化首先在预装有StrepTactin Sepharose High Performance的StrepTrap™ HP 1 ml柱中进行，随后 在StrepTrap HP 5 ml柱中进行放大，进一步放大通 过预装StrepTactin Sepharose High Performance的 29 ml XK 26/20柱进行。每一步放大蛋白的上样量都 有五倍的提升，所有柱的停留时间均为2 min左右。 图3A-C显示色谱图和操作条件。
进行再生时流速为2.5 ml/min)
Hale Waihona Puke XK 26/20 柱： 13 ml/min (用0.5 M氢氧化钠进行再生时流速
为6.5 ml/min)
系统：
ÄKTAexplorer™ 100
图 3. (His)6-mCherry-Strep(II)标签蛋白纯化的放大。(A)StrepTrap HP 1 ml，(B)StrepTrap HP 5 ml(C)预装 StrepTactin Sepharose High Performance的XK 26/20，29 ml (D)StrepTrap HP 1 ml柱加载mCherry蛋白的图 示。
EDTA, pH 8.0
洗脱缓冲液： 含2.5 mM脱硫生物素的结合缓冲液
再生：
3 倍柱体积的(CV) 蒸馏水, 3 ml 0.5 M氢氧
化钠,3 ml蒸馏水
流速：
1.0 ml/min(使用 0.5 M 氢氧化钠时为 0.5
ml/min)
系统：
ÄKTAexplorer™ 100
洗脱缓冲液
泳道
1. 低分子量标准蛋白 2. 原料 含 GAPDH-Strep(II)的大肠杆菌裂解液 3. 操作 1，洗脱合并物 4. 操作 2，洗脱合并物 5. 操作 3，洗脱合并物 6. 操作 4，洗脱合并物 7. 操作 5，洗脱合并物 8. 操作 6，洗脱合并物
通过两种层析介质对其特有标签的专一识别可获 高纯度目标蛋白。
自动化两步法纯化
MBP2*-paramyosin-δ-Sal(分子量约70000)来自大肠 杆菌裂解液，通过ÄKTAxpress™系统两步纯化获得。 MBPTrap™ HP 1 ml柱预填充有Dextrin Sepharose High Performance介质,用于自动化两步法纯化的第 一步亲和层析(AC)步骤。第二步即凝胶过滤(GF)在 HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 pg上进行。图1和2 分别显示色谱图，操作条件以及SDS-PAGE。
图 4.在同一个 StrepTrap HP 柱上进行反复的纯化和 再生。吸收曲线位于 280nm 处。
结论：
y 采用预装柱不仅方便而且节省时间 y 易于放大，且产量和纯度保持不变 y 用 0.5 M 氢氧化钠反复再生后具有高重复性
StrepTrap HP 1ml 柱 上 加 载 1 mg 的 GAPDH-Strep(II)。
层析柱：
StrepTrap HP 1 ml
样品：
大肠杆菌裂解液中GAPDH-Strep(II) (分子
量约37500)
样品体积： 1 ml
结合缓冲液： 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM
2.2 1.9
1.8
总量(mg) 2.2 9.4
52.7
层析柱：
StrepTrap HP 1 ml
StrepTrap HP 5 ml
预装有StrepTactin Sepharose High Performance的XK 26/20,
29 ml, 床高5.5 cm
样品：
大肠杆菌裂解液中(His)6-mCherry-Strep(II) (分子量约为31
结果： y 所有三个柱的产量相等 y 洗脱的目标蛋白纯度相似(数据未显示) y 容易放大
快速有效地再生
采用 0.5 M 氢氧化钠可对 StrepTactin Sepharose High Performance 柱进行简单的再生。对大肠杆菌 裂解液中的带 Strep-tag II 标签蛋白的磷酸甘油醛脱 氢酶(GAPDH)进行连续的六步纯化，并在每步纯化 后进行柱再生(图 4 和 5)。
000)
样品体积： 4.2 ml (StrepTrap HP 1 ml)
21 ml (StrepTrap HP 5 ml)
105 ml (XK 26/20 柱)
结合缓冲液： 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
洗脱缓冲液： 含2.5 mM脱硫生物素的结合缓冲液
麦芽糖结合蛋白(MBP)标签，分子量约为 42000，能 与碳水化合物特异结合。将蛋白贴上 MBP 标签往往 可以增加蛋白的表达水平，并使目标蛋白具有更高 的可溶性。Dextrin Sepharose High Performance 可 特异结合 MBP 标签蛋白。
图1.在ÄKTAxpress系统上采用两步(亲和层析-凝胶过 滤)法方案对MBP2*-paramyosin-δ-Sal进行自动化纯 化。
图 5.在同一 StrepTrap HP 柱上进行连续的六次过 柱，每次洗脱物合并后进行 SDS-PAGE 分析(还原条 件，考马斯亮蓝染色)，每次过柱后用 0.5 M 氢氧化 钠进行再生。
结果：
y 最终纯度高(SDS-PAGE 上显示纯度>95%) y 每次过柱约 85%的收率(0.85mg) y 通过 0.5 M 氢氧化钠再生后产量无下降趋势。
再生：
3 倍柱体积的(CV) 蒸馏水, 3 CV 0.5 M氢氧化钠,3 CV蒸馏
水
流速：
StrepTrap HP 1 ml： 1.0 ml/min (上样以及用0.5 M氢氧化钠
进行再生时流速为0.5 ml/min)
StrepTrap HP 5 ml： 5.0 ml/min (上样以及用0.5 M氢氧化钠
流速：
1.0 ml/min (样品存在下为0.5 ml/min)
凝胶过滤柱： HiLoad 16/60 Superdex 200 pg
样品：
MBPTrap HP 1 ml合并洗脱物
缓冲液：
10 mM 磷酸钠, 140 mM 氯化钠, pH 7.4
流速：
1.5 ml/min
系统：
ÄKTAxpress
洗脱缓冲液
GE Healthcare
MBP 标签蛋白以及 Strep II 标签蛋白的纯化
M.Carlsson,A. Heijbel 和 A.Karlsson GE Healthcare Bio-Sciences AB Björkagatan 30,SE-751 84 乌普萨拉，瑞典
介绍
重组标签蛋白可通过亲和层析的方法一步即可获 得高纯度的蛋白。蛋白标签可以是一段肽链，也可 以是一个蛋白，标签的选择完全依赖于目标蛋白的 特性以及蛋白纯化目的。
表1. StrepTrap HP和XK 26/20柱产量的概况。每一步 蛋白上样量增加5倍。
柱
StrepTrap HP 1 ml StrepTrap HP 5 ml 预装有 StrepTactin Sepharose High Performance 的 XK 26/20，29 ml
产量 (mg/ml 介质)
这里列出两种新的层析介质。StrepTactin™ Sepharose™ High Performance 利用的是 Strep-tag® II标签蛋白，与Strep-tactin配体具有高亲 和性。Strep-tag II标签蛋白的分子较小(8 aa)，非常 适合作为蛋白亲和标签，并且没有必要进行常规的 标签去除。
泳道 1. 低分子量标准蛋白 2. 原料，大肠杆菌裂解液中
MBP2*-paramyosin-δ-Sal 3. 最终凝胶过滤合并洗脱物
图 2.纯化的 MBP2*-paramyosin-δ-Sal 蛋白进行的 SDS-PAGE 分析(还原条件，考马斯亮蓝染色)
结果：
y 两步后产量为 2.2mg y 总的纯化时间仅需 3.4h y 洗脱后的目标蛋白具有高纯度