流感病毒HA球状头部结构域在昆虫杆状病毒表达系统的表达及鉴定

DC)I：10. 13350/j. cjpb. 210302 •论著•流感病毒H A球状头部结构域在昆虫杆状病毒表达
系统的表达及鉴定<
曾博宇李凯1•—‘，张桐于潼:，庄忻雨」，陈璐儿陈振海1…，田明尧」• •，金宁一•
(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225100;2.军事医学研究院军事兽阪研究所；3.吉林大学动物医学学院）
______目的通过昆虫杆状病毒表达系统获得具有良好免疫原性的流感病毐蛋白。

方法将Hemagglutinin[In­
【摘要】
fluenza A virus (A/California/09/2009(H1N1)) 进行截短，取 57-271 球状头部结构域铽基酸序列，在前面加IgK leader 信4•肽（M E T D T丨丄LW VI丄LW VPGSTGD),设计H I H A H t'a d基I I将基闪序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优
化、合成.通过E c o R I和H i n d i n双酶切克隆至pFastBAC H T A载体1-.,获得含有目的基W的重组质粒pFastBAC H T A-
H lH A H e a d。

利用热激法将重组质粒转化至大肠埃希菌D H10 感受态细胞，蓝〖I斑筛选获得1组杆状质粒rBac-
mid-H lH A H e a d。

在脂质体的介导下，将重组杆状质粒转染至SF9细胞，对病毒进行拯救.转染后120 h，收取上清病毐 液•盲传3代，获得SF9细胞，运用间接免疫荧光法（IF A)和Western b l o t检测11的蛋白的表达。

结果经双酶切鉴定 成功插人长度为762 b p的目的基因HI H A H ead,通过脂质体介导长度为3 192 b p的重组杆状质粒rBacmid-HI H A H e a d构建成功。

杆状病毒系统可表达目的蛋白，其分子质M单位28.25 k u,与预期一致。

Western b l o t鉴定该蛋 白能与特异性标签H i m g发生反应.1F A鉴定感染重组病毒的SF9细胞外源蛋白表达。

结论通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达U的蛋内，该蛋白有反应性.为流感抗体检测和新塑疫苗的幵发奠定了基础。

流感病毒：昆虫杆状病毒；表达；疫苗
【关键词】
【中图分类号】R373. 1【文献标识码】A【文章编号】1673-5234(2021)03-0253-05
^journal o f Pathogen Biology.2021 M a r； 16(3) ：253 — 257.]
Expression and identification of the globular head domain of influenza virus HA in an insect baculovirus expression system
Z E N G B o-yu1-',LI Kai1'2, ZHANG Tong2', YU Tong1',Z HUA NG Xin-yuL，, CHEN L u-er ;, CHKN Zhen-hai1，TIA N Ming-yao」，JIN Ning-yi1.」College o f Veteritmry M edicine，Yangzh o u Univer­sity ^YuTigzhou ^Jiangsu225100, China ；2. Institute o f M ilitary Veterinary Medicine *A cadem y o f M ilita ry M edi­cine ;3. School o f A n im a l Medicine »Jilin University)* **
[Abstract]Objective To obtain an influenza virus protein with good immunogenicity using an insect baculovirUvS ex­pression system. Methods Hemagglutinin [influenza A virus ( A/California/09/2009 ( HIN1 )」was truncated， a se- quence of 57-271 amino acids constituting the globular head domain was obtained, and an Ig k leader signal peptide (met- dtllwvlllwvpgstgd) was added in front of it. The sequence was cloned in a pFastBAC H TA vector using EcoRI and Hindl- II digestion. The recombinant plasmid was transformed into DH10 Bac N I competent cells via the heat shock method for blue and white spot screening. White colonies were selected and a second round of blue and white spot screening was per­formed. White colonies were selected and inoculated on triple antibody medium. Recombinant rod-shaped particles were extracted on an adsorption column. The recombinant plasmid was transfected into Sf9 cells using liposomes. Five hours after transfection, the solution was changed. One hundred and twenty h after transfection, the cell supernatant was col­lected and centrifuged at 3*500 rpm for 5 min and then filtered with a 0. 22-^tm membrane. The filtrated was inoculated in Sf9 at a 1 % volume. Cells were cultured for 72-96 h, the supernatant was collected, and steps were repeated to obtain a thrice-passaged recombinant virus. The thrice-passaged recombinant virus was inoculated into Sf9 and verified using Western blotting and IFA. Results The target gene hlhahead, 762 bp in length, was successfully inserted using double enzyme digestion. The recombinant rod-shaped plasmid rbacmid-hlhahead，3, 192 bp in length，was successfully con­structed using liposomes. The target protein was expressed in a baculovirus system, and its molecular weight was 28. 25
【基金项目】国家重点研发计划资助项目（N a2017Y F D0501803);2020年长春市新塑冠状病毒肺炎（N C P)疫情防控应急科研攻关项目，新型冠状病毒肺炎重组蛋白疫苗研发项目（NO.2020RW003)。

■ _金宁一，E-mail:***************:陈振海，E—mail:zhenhai@yzu. edu. c n;田明亮，E—mail:klwklw@126. com
■曾博宇（1997—)，男，江苏人•硕士。

研究方向：预防兽医学。

E —m ai l:189****************
ku< which was consistent with the expectation. Western blotting indicated that the protein reacted with his tag. IFA indi­cated that the protein was expressed in Sf9 cells infected with the recombinant virus. Conclusion The target protein was successfully expressed in a baculovirus expression system. The protein was reactive. This finding has laid the foun­dation for the detection of anti-influenza antibodies and the development of new vaccines.
【Key words】influenza virus*insect baculovirus,expression.vaccine
流行性感冒病毒（i n f l u e n z a v i r u s)，简称流感病毒，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae)，基因组为分 节段负链R N A,由8个R N A片段组成，编码至少11 种蛋白。

根据N P蛋内的不同，流感病毒分为甲型、乙型和丙型，E卩A、B、C型1。

根据病毒表面糖蛋白H A 和N A的抗原性差异可分为18个H A亚塑和11个 N A亚型。

H A为流感病毒的血凝素，由R N A第4区段编码，全长1742-1778nt,是流感病毒主要抗原基因之一 j。

H A抗原具有免疫原性，能诱导机体产生保护性抗体，但是容易发生变异，这也是流感流行的主 要原因之一。

导致甲型流感病毒抗原高度易变的主要 原因是高发的突变率和基因重排1。

20世纪以来，已经至少在人群中发生了 3次由甲型流感病毒引起的世 界范围流感大流行（1918年西班牙H1N1流感、1957 年亚洲H2N2流感及1968年香港H3N2流感广。

流感病毒具有高度传染性，能在短期内突然发生并迅速蔓延，甚至发生世界性大流行6:。

2017年末到2018年初出现流感肆虐，各地流感 病毒检测阳性率达到很高水平，预防流感发生与传播的最好方式是疫苗接种.而病毒的H A蛋白作为流 感病毒主要的免疫组份在疫苗中发挥重要作用s:l。

流 感病毒H A蛋白是主要诱发保护性免疫反应的抗原位点.H A的作用是绑定到宿主细胞受体从而诱导病毒进人，因此是中和抗体的主要目标。

杆状病毒表 达系统（baculovirus expression system，BES)，是以杆 状病毒为表达载体的真核表达系统，以其安全、高效、稳定的特性而得到广泛应用1。

B E S中使用的表达 细胞为昆虫细胞，可对表达的外源蛋白进行较为完善的翻译后加工修饰，例如糖基化、磷酸化和酰基化等，保证了外源蛋白的生物学活性11。

杆状病毒只能感染昆虫宿主，对人、畜及农作物均无危害；同时昆虫细 胞也不能被人类病原体所感染.降低了表达的外源蛋白被污染的风险，因此安全性得到保证12_11。

本研究 拟通过优化合成甲型流感病毒的基因，并在末端添加 6X H I S标签基因，再将其插入pFastBAC H T A的多 角体蛋白启动子（polyhedrin promoter)pPh 和 pP10 启动子后.利用Bac-t o-Bac杆状病毒/昆虫细胞系统表 达目的蛋白并进行鉴定，为流感疫苗的开发奠定基础。

材料与方法1材料
1.1栽体和菌种 D H10 Bac:M感受态细胞购自博迈德生物公司；杆状病毒转移载体pFastBAC H T A及 SF9细胞由本实验室保存。

1.2仪器、工具酶以及试剂 T4D N A连接酶购自美 国N E B公司；Goat Anti-Mouse IgG H&-L (H R P&FITC)，克隆感受态细胞TranshTl，Blue Plus Protein Marker 及 ProteinFind Anti-His Mouse Monoclonal Antibody均购自北京全式金公司；限制性内切酶和D N A mark购自日本TaKaRa公 司；牛血清白蛋白第五组分（BSA V)购自中国Germ-ho l d公司；X-gal ，庆大霉素溶液，盐酸四环素，IPTG 溶液购自中国Sol a r b i o 公司；FastDigest Hind I I I、FastDigest EcoR I和 GibcoGrace’s I n s e c t Medium Unsupplemented 购自美国Thermo Sci e m i f i c.M公 司；胎牛血清购自美国GBIC()公司。

2方法
2.1引物和序列合成 H l H A H e a d基因由吉林省库 美生物科技有限公司优化及合成。

通用引物PUc/ M13F：S'-C C C A G T C A C G A C G T T G T A A A A C G-S S PUc/M 13R ：5A G C G G A T A AC A A T T T C A C A C A G-G-3，。

2.2重组质粒的构建和鉴定将pFastBAC'HTA载 体进行EcoR I和Hind HI双酶切，对酶切获得的产物进行胶回收，参照T4连接酶操作说明连接pFastBAC H T A载体和H l H A H e a d基因。

将连接产物转化感受态细胞，挑取单个菌落进行培养。

提取质粒，进行酶 切鉴定并测序（由吉林省库美生物科技有限公司完成）。

2.3重组杆状质粒的制备将构建的质粒pFast-BAC H T A-H I H A H e a d,于 42 •(：热刺激 45 s 转化到 D H10 Bac™感受态细胞，冰上静置2 min。

分别加入 900 p i S. (). C 培养基，37 'C、225 r/min，震荡培养 4 h。

取100^1菌液均勻涂布于含有四环素（10m g/L)、硫酸卡那霉素（50 m g/L)、庆大霉素（7 m g/L)、IPTG (40 m g/L)/X-G A L U O O m g/L)的蓝白斑筛选平板上，37 C倒置培养48 h以上。

挑选白斑，加人2 m l三 抗L B培养基（硫酸卡那霉素、庆大霉素和四环素）37 C、250 r/min，震荡培养过夜。

取100 pi菌液再次涂 布蓝白斑筛选平板，37 C倒置培养48 h以上。

挑取
白色菌落，接种在800 pi三抗L B培养基37 X：，225 r/ min，震荡培养4 h,取10 pi菌液，4 000 r/min(离心半 径13. 5 cm)离心1min,弃上清，加人P C R反应体系 重悬沉淀做P C R鉴定。

另取600 j u l菌液按1 :1 000 比例加人6 m l新鲜三抗L B培养基，37 C,225 r/ m m.震荡培养12 h。

采用不过吸附柱的方式进行重组杆粒rBacmid-H l H A H e a d的提取。

2.4 重组杆状病毒的拯救SF9细胞密度在1.5X 106〜2. 5 X 106个细胞/m l范围内时，存活率高达95%以上。

提前1 d铺六孔板，将六孔板中培养基更换为1 m l双无Grace’s培养基。

取8 j u l转染试剂 C e l l f e c t i n.、1 H Reagent 加人 100 p i 双无 Grace’s培养 基，轻轻混匀后室温静置15 min。

取3 p g重组杆粒 D N A加人100 ^1双无Grace’s培养基，轻轻混匀后加 人稀释的转染试剂C e l l f e c t i n_M I I Reagent,轻轻混匀，室温静置20 min后均匀加人六孔板中，27 ~C培养 5 h，换液SF-900II完全培养基，27 °C培养5〜7 d,细 胞出现病变，收取细胞上清液为第一代重组杆状病毒，继续盲传3代。

2.5间接免疫荧光法鉴定蛋白的表达按1%体积 比将P2代重组杆状病毒接种于SF9细胞中，同时设 立阴性对照。

待细胞出现明显病变（C P E)后弃去培养 基，用P B S清洗3次；用预冷的4%多聚甲醛室温固定 10 min，弃去，P B S洗3次；加人终浓度0. l%Tri-11〇1^-100和2%1^八破膜封闭3〇111丨11，？1^洗3次；加人 Anti-His Mouse Monoclonal Antibody —抗（1 : 1000稀释），37 X：孵育1h,P B S洗3次；加人Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)二抗（1 : 2 000 稀释），37 'C孵育1 h,P B S洗2次，荧光显微镜拍照。

2.6 Western blot检测蛋白的表达收取感染重组病毒的SF9细胞，用IP细胞裂解液裂解后13 000 r/ min(离心半径1
3. 5c m)离心5 min,收取上清，加入 5XSDS-P A G E电泳上样缓冲液制备蛋白样品,经通过 SDS-P A G E电泳后转印至硝酸纤维膜上，分别以An­t i-H i s Mouse Monoclonal Antibody (1:2 000)为 —■抗，（1 : 5 000)为二抗进行 Western b l o t 鉴定。

结果
1重组质粒的鉴定
将构建的重组质粒pFastBAC HTA-HIHAHead 用EcoR I和Hind 111双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳 的得到约762 b p目的片段，与合成片段预期大小-致 (图1).重组质粒构建成功。

bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
bp
762
1,2 重组质粒pFastBAC H T A-H I H A H e a d被EcoR I和Hind I I I双酶切M D N A标志物
图1重组质粒的双酶切鉴定
1，2 Recombinant plasmid pFastBAC H T A-H I H A H e a d digested by EcoR I and Hind III M DNA marker
Fig. 1Identification of recombinant plasmid
by double enzyme digestion
2重组杆粒的鉴定
用通用引物P U c/M13F和P U c/M13R分别对两 个重组杆状质粒进行P C R验证，1%琼脂糖凝胶电泳显示目的片段大小与预期一致（图2),重组杆粒构建成功。

bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
M DN A标志物（DL5000 ) 1、2 重组杆状质粒rBacmid-H l H A H e a d PCR 产物
图2 重组杆粒的P C R鉴定
M DNA marker ( DL5000) 1，2 PCR products of rBacmid-H lH A H e a d
Fig. 2 PCR identification of recombinant plasmid
3重组杆状病毒的拯救
用重组杆粒D N A转染SF9细胞，分别于转染72 h和120 h在普通倒置荧光显微镜下观察。

阴性对照 组细胞无变化，细胞正常生长，大小均一（图3A)。

转 染细胞在转染后72 h变大变圆且停滞生长（图3B); 120 h时细胞大量死亡，漂浮细胞增多（图3C
)。

A正常S F9细胞B重组杆粒感染S F9细胞72 h病变C道组杆粒感染S F9细胞120 h病变
图3重组杆状病毒的拯救（100X)
A Normal Sf9 cells
B Infected with recombinant plasmid for 72 hours C' Infected with recombinant plasmid for 120 hours
Fig. 3 Rescue of recombinant haculovirus (I00X )
4间接免疫荧光检测目的蛋白的表达
用重组病毒感染SF9细胞.利用Anti' His Mouse Monoclonal Antibody单抗作为一■抗和炎光标记的二 抗进行免疫荧光检测，感染细胞可检测到绿色荧光.证 明有外源蛋白表达（图4)。

蛋白能够诱导机体产生中和抗体，H A蛋白头部球状 结构是流感病毒主要的保护性抗原K域1。

有证据 表明，在对免疫占主导地位的H A头部区域具有特异 性的M15(J(memory B-c e l l)的存在下，抗莲抗体反应会减弱。

头部区域阻断病毒受体结合位点，并且有 4个抗原决定簇Ca、C b、S a和Sb,头部区域抗体能引起比颈部区域更强的体液免疫1。

因此，…种以球状 头部结构域氨基酸序列为靶基因的疫苗的开发具有重 要意义。

A —抗标记的重组蛋白rBacm id-H lH A H ead B空白对照组
图4间接免疫荧光法检测的rBacm id-m H A llead表达
A rBacmid H 1 HA H ead labeled with primary antibody
B Blank control group
Fig. 4 The expression of rbacmid-hl hahead detected by IFA
5 Western h lo t检测目的蛋白的反应原性
利用脂质体转染法将重组杆状质粒转染至SF9细胞，于27 C温箱培养5〜7 d，待细胞出现约60%病 变时收取上清，按照1 :1 〇〇〇的比例加人长至约60%融合度的SF9细胞的6孔板.盲传3代，待细胞出现约60 %病变收取细胞沉淀进行裂解破碎.SDS-PAGE 电泳后转膜，以Anti-His Mouse Monoclonal Anti-body作为一抗和H R P标记的山羊抗鼠二抗进行Western blot(图5)，在约28 k u处有一反应条带。

讨论
流感病毒血清型众多，抗原易突变.能够感染人和 动物，每年都有季节性流感流行1。

H前，世界范围 内使用的流感病毒疫苗以灭活裂解疫苗和减毒活疫苗 为主，其中灭活裂解疫苗被更多的国家批准使用:1'。

但是，由于流感病毒的宿主范围广、数量多、共生情况 复杂，该病毒在进化和传播过程中不断突变，每年都会 有不同的流行株出现K，所以需要每年都要进行流行 病学调查和新墦相关疫苗的研制.这不仅成本高.而且 不能满足疫情防控的需求+。

由于流感病毒的H A
70
25 麵
M蛋内分子质量标准1空白对照 2 重组蛋n rBacmid- HlH AH ead与相应抗体反应条带
图5 重组蛋白Western blot鉴定
M Marker 1Blank control 2 Purpose strip
Fig. 5 The recombinant protein identified by WB
杆状病毒表达系统是以杆状病毒为表达载体的真 核表达系统.以其安全、高效、稳定的特性而得到广泛应用.可对表达的外源蛋白进行较为完善的翻译后加工修饰.保证了外源蛋白的生物学活性=。

杆状病毒 只能感染昆虫宿主，对人、畜及农作物均无危害；同时 昆虫细胞也不能被人类病原体所感染，降低了表达的外源蛋白被污染的风险，因此安全性可以得到保证。

本实验通过杆状病毒表达系统表达外源基因，并在基因的N端插人了 His标签，以便于目的蛋白的 鉴定」。

通过双酶切将目的基因与pFastBAC H T A 载体相连接，获得重组杆状质粒，通过脂质体转染SF9细胞获得重组杆状病毒.成功表达目的蛋白，Western blot鉴定蛋白具有反应性，为研发通用型流感病毒
抗
体E LIS A检测试剂盒和通用塑流感疫苗的研发奠定
了基础。

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