雌激素对GT1-7细胞GnRH分泌及相关基因表达的影响

雌激素对GT1-7细胞GnRH分泌及相关基因表达的影响吴晓敏;韩向敏;许晓玲;白佳桦;刘彦;冯涛
【摘要】[目的]研究低浓度雌激素对下丘脑GnRH分泌以及ERα、GnRH等6个生殖相关基因表达的影响.[方法]采用体外培养GT1-7细胞,对照组添加溶剂(无水乙醇),试验组添加雌激素(100 pmol/L),培养1、3、6、12、18、24、30、36 h收集细胞和培养上清液,利用酶联免疫法(ELISA)测定收集上清液中GnRH浓度,并利用相对荧光定量法测定目的基因的表达.[结果]与对照组相比,试验组GnRH分泌呈增加趋势,培养12 h左右GnRH分泌达到峰值(P<0.05);ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54 mRNA相对表达量先增加后降低,4种基因mRNA依次在18 h(P<0.01)和24 h(P<0.05)、6 h(P<0.01)、3 h(P<0.01)、6 h和12 h(P<0.05)表达显著增加.nNOS和c-fosmRNA相对表达量较对照组呈降低趋势,这2种基因mRNA依次在30 h和36 h(P<0.05)、3 h(P<0.01)表达显著降低.[结论]100 pmol/L雌激素能够促进GT1-7细胞分泌GnRH,这种作用可能是通过调控ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS以及c-fosmRNA的表达实现的.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2017(052)001
【总页数】8页(P13-20)
【关键词】雌激素;GT1-7细胞;GnRH;基因表达
【作者】吴晓敏;韩向敏;许晓玲;白佳桦;刘彦;冯涛
【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州 730070;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州
730070;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
动物的生殖活动受到下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonad，HPG)的精密调控，其中下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是其调控的关键激素.神经元是动物发情周期启动的关键部位，且GnRH是动物情期启动和发情行为的重要信号.目前，关于动物初情期启动存在2种主要理论假设.其一是组织器官发育理论假说，即动物各组织和器官发育达到一定阈值后才启动初情期[1]；其二是雌激素反馈理论[1-3].雌激素回馈理论是确保动物体成熟和性成熟同步性的关键.雌性动物中，雌激素(17β-Estradiol，E2)通过直接或间接方式作用于GnRH神经系统，调控GnRH最终分泌至正中隆起，进而调控整个生殖系统[4-5].雌激素是一种类固醇激素，主要通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合，从而产生一系列生理学效应.GnRH神经元是哺乳动物中枢生殖调控体系的最终共同通路，但在人和哺乳动物的脑内数量很少，仅约1000～3000个，弥散地分布于前脑的嗅区、隔区及下丘脑等区域.下丘脑是由许多功能各异的神经核团组成的结构复杂的器官，要想在体内精确研究雌激素对GnRH神经元及其相关功能的研究难度很大.目前，相当多的研究是利用下丘脑产生的GnRH神经元细胞系GT1-7细胞作为体外模型开展相关研究工作.GT1-7细胞是GT1细胞株的一个亚株，是通过转基因技术从小鼠下丘脑分离获得的促性腺激素释放激素(GnRH)神经细胞系，具有高度分化的神经内分泌细胞的典型特征[6].GT1-7细胞的表型形态、超微结构、基因表达、激素储存以及分泌的方式均与
GnRH神经元完全一样，且能在体外分裂传代，是体外研究下丘脑GnRH神经元
的理想细胞模型[7].本研究用低浓度的雌激素作用于GT1-7细胞，观察不同作用时间GnRH分泌以及相关基因表达的变化规律，初步揭示雌激素调控GnRH的机理.
1.1 材料
GT1-7细胞株：美国加州大学Pamela L Mellon教授惠赠.
1.2 主要仪器
生物安全柜(Heal Force，中国)、恒温CO2培养箱(Thermo，美国)、倒置显微镜(OLYMPUS，日本)、酶标仪(Thermo，美国)、分光光度计(Eppendorf，德国)、荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)、电泳仪(六一，中国)、凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)等.
1.3 主要试剂
DMEM高糖培养基、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清、青霉素/链霉素液体均购于美国Gibco公司，17β-雌二醇购自美国Sigma公司，小鼠促性腺激素释放激素(GnRH)酶联免疫检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所.细胞总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒、Taq PCR Mastermix、SYBR Green PCR试剂盒等均购于天根生化科技有限公司，本试验中所用PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成.
2.1 GT1-7细胞的培养
将GT1-7细胞复苏于完全培养基(10%胎牛血清、青霉素/链霉素各100 IU/mL)，培养温度37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中.培养2～3 d待细胞铺满培
养瓶约90%，用1×PBS洗两遍，再用0.25%胰酶-EDTA进行消化，在显微镜下
观察，大约有一半细胞变圆，另一半开始变圆时，即可加入含有血清的培养液终止消化，然后用吸管反复吹吸把贴壁的细胞吹下来，收集至离心管；室温离心，转速800 r/min，4 min；弃去上清液，加入新鲜的完全培养基，尽量成单细胞悬液，
然后放于培养箱中培养.细胞复苏后传代约3次达到需要细胞量.将细胞悬液制成
2×105个/mL，然后接种于12孔板.待细胞生长铺满约80%～90%后，将对照组与试验组中完全培养基换成无血清培养基，同时给予试验组雌激素(100 pmol/L)处理，处理时间分别是1、3、6、12、18、24、30和36 h，每种处理设3个重复，每组实验重复3次，用无菌管收集细胞培养上清液以及细胞沉淀.将细胞上清液2 000～3 000 r/min离心20 min，保存于-20 ℃.收集的细胞沉淀中加入适量裂解液(含β-巯基乙醇)，漩涡震荡后保存于-20 ℃，备测.
2.2 激素测定
采用南京建成生物工程研究所生产的小鼠促性腺激素释放激素(GnRH)酶联免疫检测试剂盒，测定上清液的GnRH浓度，具体操作见说明书.
2.3 样品总RNA提取
根据细胞总RNA提取试剂盒说明书操作，RNA液收集于RNase-Free离心管中.用紫外分光光度计法检测提取的RNA的浓度和纯度，D260/D280在1.8～2.0之间表示纯度合格，可继续进行逆转录试验.
2.4 逆转录
把提取的各个样本的总RNA进行逆转录为cDNA，参照TIANGEN Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作，转录体系为20 μL，模板量为1.9 μg.整个操作于冰上进行.逆转录体系配制好后于37 ℃孵育60 min，获得的cDNA用管家基因PRL19为引物(表1)，经PCR扩增检测后4 ℃保存待用.
2.5 相对荧光定量Real-time PCR(qRT-PCR)
以管家基因PRL19为内参基因[8]，利用相对荧光定量PCR检测样本mRNA的相对表达量.根据TIANGEN的FastFire快速荧光定量PCR预混试剂盒说明书操作，三步法反应程序.反应体系为20 μL，2×FastFire qPCR PreMix 10 μL，正向引物和反向引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，RNase-Free ddH2O 10.6 μL，整个操
作在冰上进行.试验中的引物是参照已发表文献和利用Primer 5.0软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成.反应程序为：预变性阶段95 ℃、1 min；PCR 反应阶段变性95 ℃、5 s，退火10 s，延伸72 ℃、15 s，40个循环(表1).相对荧光定量PCR阴性对照是用1 μL ddH2O代替模板，试验组对每个样品检测做3个重复.利用实时荧光定量软件(Bio-Rad CFX Manager3.1)自动读取Cq值.
2.6 数据统计分析
GT1-7细胞培养上清液GnRH浓度的测定是利用酶标仪读取D值，依据GnRH 标准曲线得出样本GnRH浓度.基因相对表达量根据实时荧光定量软件(Bio-Rad CFX Manager3.1)自动读取的Cq值，采用2-△△Cq法计算[9]，计算公式为：ΔCq=目的基因Cq值-内参基因Cq值，ΔΔCq=试验组ΔCq值-对照组ΔCq.所有数据运用GraphPad Prism 5.0统计学软件进行分析，结果以平均值±标准差形式表示.
3.1 雌激素对GT1-7细胞GnRH释放的影响
经ELISA检测分析，GnRH浓度标准曲线，R2=0.991)的相关系数大于0.99，结果可信.由GnRH质量浓度标准曲线和所测得样本D值计算出样本中GnRH质量浓度，统计分析结果见图1.可见培养期间，试验组培养液中GnRH含量较对照组呈增加趋势，在培养12 h时，试验组GnRH含量出现峰值，显著高于对照组(P<0.05).
3.2 目的基因PCR扩增结果
以GT1-7细胞cDNA为模板，以PRL19、ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS和c-fos基因为引物进行PCR扩增，目的基因扩增产物大小分别是185、235、247、154、204、200和68 bp，经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，与预期结果一致(图2).
3.3 雌激素处理GT1-7细胞ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS、c-fos mRNA不同时间相对表达量差异
以相同时间点对照组基因表达量为1，ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS、
c-fos mRNA不同时间相对表达量见图3.ERα mRNA表达量随培养时间延长呈增加趋势，尤其在18 h和24 h(P<0.05)，30 h和36 h时ERα mRNA稍有降
低.GnRH mRNA表达量随培养时间延长呈增加趋势，其中6 h的表达量极显著增加(P<0.01).Kiss-1 mRNA表达量随培养时间延长呈增加趋势，在培养3 h时其相对表达量极显著增加(P<0.01)(图3-C).GPR54 mRNA相对表达量随培养时间延长呈增加趋势，6 h和12 h时显著增加(P<0.05)，30、36 h时表达量降低
(P>0.05)(图3-D).试验组nNOS mRNA表达量较对照组在3 h时增加(P>0.05)，其他时间点都较之降低，其中30、36 h时显著降低(P<0.05)(图3-E).试验组c-
fos mRNA相对表达量较对照组呈降低趋势，在3 h时极显著降低(P<0.01).以上
结果显示：ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54 mRNA相对表达量呈先增加后降低趋势，ERα在18 h和24 h，GnRH在6 h，Kiss-1在3 h，GPR54在6 h和12 h
时达到峰值，nNOS和c-fos mRNA相对表达量较对照组呈降低趋势，分别在30、36、3 h时处于低谷.
4.1 雌激素对GT1-7细胞GnRH释放的影响
GnRH是动物情期启动和发情行为的重要信号，是由下丘脑神经元分泌的酰胺化
十肽，GnRH调节垂体中促性腺激素细胞分泌促卵泡素(FSH)和黄体生成素(LH)，促性腺激素(FSH，LH)作用于性腺(雄性的睾丸和雌性的卵巢)，调节性激素的分泌
并影响生殖活动.另外，垂体分泌的促性腺激素可反馈调节下丘脑GnRH的分泌；
同样，性腺激素也可反馈调节下丘脑和垂体相应激素的释放.因此，在下丘脑、垂
体和性腺之间形成了一条密切相连的轴线系统，即HPG轴.GnRH神经元是HPG
轴调控机制的关键.目前，GT1-7细胞是体外研究GnRH神经元的理想细胞模型[7].动物体内研究表明：给卵巢摘除的小鼠连续外源注射雌激素，可诱导GnRH和LH 峰的产生[10]；温和地持续注射雌激素(E2)(50 μg/kg，5 d)[11]以及大剂量一次性注射雌激素(10 mg/kg)[12]，均能诱发大鼠出现真性性早熟.本试验测定了雌激素(100 pmol/L)处理GT1-7细胞不同培养时间GnRH的分泌，结果显示雌激素对GT1-7细胞GnRH的分泌有一定的促进作用，且呈现一定节律性.此结果与Tonsfeldt等[13]和Navarro等[14]研究结论基本一致，只是本试验中GnRH分泌峰值出现时间较之Tonsfeldt等[13]研究结果提前，这可能与选择雌激素刺激的时间点以及雌激素处理前细胞培养液中血清的含量等有关.E2除了通过调控下丘脑GnRH调节生殖活动以外，还对卵母细胞核成熟发挥调控作用.研究发现，E2可促进卵母细胞的核成熟率(P<0.05)，并推测E2不需要卵丘细胞介导而直接作用于卵母细胞，来调节卵母细胞核成熟以调控生殖[15].
4.2 雌激素对GT1-7细胞基因表达的影响
GnRH分泌调控是深入揭示动物情期启动的关键因素，雌激素调控GnRH神经元是HPG轴调控机制的关键.Kiss-1基因编码的蛋白kisspeptin与其受体GPR54一起被认为是青春期发育启动的“分子阀门”，kisspeptin通过GPR54刺激动物GnRH的分泌[16]，Kiss-1/GPR54基因突变可导致特发性促性腺激素分泌不足型腺机能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH)[17].当体内循环E2处于低水平时，能够刺激下丘脑弓状核Kiss-1 mRNA表达；高水平E2能够抑制Kiss-1 mRNA表达.E2通过与ERα结合直接作用于Kiss-1神经元调控Kiss-1 mRNA表达，继而作用于GnRH 神经元[18].Tonsfeldt等[13]在利用
GT1-7细胞研究kisspeptin、E2以及骨形态发生蛋白4(Bone morphogenetic protein，BMP4)之间相互作用对GnRH分泌的影响时发现，kisspeptin引起
GnRH分泌可能部分依赖E2活性，当E2(100 nmol/L)存在的情况下，kisspeptin能够很好的通过MAPK-AKT信号通路，诱导GnRH mRNA的表达并提高ERα和ERβ mRNA表达，同时E2也能增加GnRH神经元对kisspeptin敏
感性，增加GPR54 mRNA表达，提示在GT1-7细胞中E2和kisspeptin能相互
促进活性以调控GnRH释放.本试验在添加了低浓度E2(100 pmol/L)后，ERα和Kiss-1 mRNA表达量均呈增长趋势，且在18 h和3 h极显著升高，GPR54 mRNA的表达在6 h、12 h显著提高，与Tonsfeldt等研究结论基本一致.青春期启动是一个复杂的生理过程，GnRH的分泌调控是深入揭示动物情期启动的关键
因素.研究发现，在大鼠发育过程中，下丘脑Kiss-1和GnRH mRNA表达呈现正
相关性，且Kiss-1基因活化早于GnRH[19].本研究中GnRH脉冲分泌峰出现于添加E2(100 pmol/L)后12 h，此时显著高于对照组.GnRH和Kiss-1相对表达量在
6 h和3 h时极显著高于对照组，GnRH比Kiss-1活化稍晚这一现象与体内实验
研究结论一致.GT1-7细胞GnRH mRNA相对表达量大幅度增加的时间早于培养
液中GnRH脉冲分泌峰时间，可能与蛋白表达滞后于基因表达，基因转录后存在
翻译、蛋白修饰等过程有关.研究还发现，GT1-7细胞在缺乏E2刺激的情况下，GPR54 mRNA呈现出低表达水平[20]；E2(100 pmol/L)存在的情况下表现出高表达的现象[13].而Dungan等[21]研究发现在敲除GPR54基因小鼠依旧对E2处理做出积极反馈，表明GPR54对E2作用的反馈调节并不是起决定性作用.在GT1-7细胞中E2调控GnRH释放可能还存在Kiss-1/GPR54以外的其他途径.
GT1-7细胞表达nNOS，而在大鼠下丘脑中GnRH神经元并不表达nNOS，但是GnRH神经元被nNOS神经元所包围[22].kisspeptin和nNOS神经元存在形态学上的相互作用[23-24]，nNOS神经元表达ERα[25-26]以及kisspeptin受体[24]，下丘脑视前区E2正反馈过程中直接作用目标可能是nNOS神经元[22].同时kisspeptin信号通过Ser1412磷酸化经由AKT途径模拟E2的正反馈从而促进
nNOS的活性[27].研究还发现，E2可通过改变nNOS磷酸化水平调节nNOS的
活性[28].因此，一方面E2可能直接与其受体结合；另一方面，E2可能通过调节nNOS的活性产生NO，NO被认为是GnRH神经元兴奋性的天然调节剂，从而
调控GnRH脉冲分泌[27].本试验在E2处理GT1-7细胞3 h时，nNOS表达提高，但不显著.其他时间nNOS表达量下降，在30 h、36 h时极显著降低，在GT1-7
细胞上 E2对nNOS活性的调控还需进一步研究.
在GnRH神经元上，c-fos蛋白常被作为神经元活性的一个指标，在GnRH脉冲
分泌的时候，能够表达c-fos[29].研究发现，E2能够调控大量同源框(Hox)基因编码转录因子，E2(10 nmol/L)处理GT1-7细胞能够诱导c-fos和c-myc转录因子
对E2作用做出反馈，同时c-myc和ER相互促进，从而使其他信号转导通路微调E2依赖信号通路[30-31].研究发现褪黑激素(Melatonin，MLT)可通过抑制cAMP 活性，激活PKC和AMPK活性，从而抑制GT1-7细胞 GnRH分泌，与此同时褪黑激素还能提高c-fos和junB的表达水平[32].Glidewell-Kenney等[33]研究发
现神经激肽B(Neurokinkin B,NKB)可能通过诱导c-fos转录因子活性来抑制
GT1-7细胞脉冲分泌GnRH.本研究中，E2能促进GT1-7细胞分泌GnRH，并伴
随着c-fos表达量下降，但是不明显.
雌激素(100 pmol/L)能够促进GT1-7细胞脉冲分泌GnRH，且呈现一定节律性；在培养12 h前后，GnRH分泌量达到峰值.雌激素(100 pmol/L)可能通过调控
ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS以及 c-fos mRNA促进GT1-7细胞分泌GnRH，进而调控生殖系统.
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