嗜热菌实验

前言
1.1研究目的和意义
本次创新实验周本小组所研究课题是从焦化厂的熄焦池中高温筛选分离出嗜热菌并探究其最高生长温度和对吲哚，喹啉，苯酚和吡啶的降解能力。

嗜热菌是一类能生活在50℃以上高温,最适生长温度在45一80℃以上的一类极端微生物自从1879年米奎尔从法国塞纳河中分离到能在70℃环境下生长的杆菌以来,嗜热菌的研究热潮始于上世纪的六七十年代,但是自Brock T.D(1969)从美国黄石国家公园的温泉中分离到最适生长温度高达70℃的水生栖热菌以后[1],在近30年里,世界各国科学家不断从陆地温泉和深海海底温泉等高温生态环境分离到许多新的、生长温度更高的高温菌、超高温菌,大约70个属140种。

并采用最先进的研究手段对这些高温菌的分类、生理、生化、生态、遗传、生物工程等进行了广泛深入的研究。

对这种“嗜极生物”有了一连串惊人的发现,对它的生存环境有了较多的了解。

从70年代Brock发现嗜热菌以来,日本、意大利、冰岛、美国等国家大力开发嗜热菌资源。

目前已发现20多个属,生活在高温环境中如热泉、堆肥、地下矿井、深海火山喷口附近区域。

根据它们的耐热程度，可分为 5 个类群：耐热菌、兼性嗜热菌、专性嗜热菌、极端嗜热菌和超嗜热菌，见表一：
表一嗜热菌的分类
对嗜热菌的研究不仅具有重要的理论意义，由于嗜热菌细胞和酶蛋白独特的耐热性和与之相适应的分子结构，使之成为人们开发利用的重要生物资源，在基因工程、发酵工程、环境保护及矿产资源的开发利用上均有很大的应用价值。

（1）在基因工程中，它可为基因工程菌的建立提供特异性基因，此外从嗜热菌提取出来的一些耐高温的酶类，也是生物工程不可缺少的重要工具，如Thermus aquaticus 中分离的DNA 聚合酶已被广泛地应用于聚合酶链式反应中的DNA 扩增。

（2）在发酵工业中，可以利用其耐高温的特性，提高反应温度，增大反映速度，同时可以减少中温型杂菌污染的机会。

（3）利用嗜热菌对废水废料进行厌氧处理，可提高生物降解速率，进而提高处理效率，同时可以消灭污水污物中的病原微生物。

（4）嗜热菌对某些矿物有特殊的浸溶能力，对某些金属具有较强的耐受能力，利用这类微生物，为矿产资源的开发提供了有希望的前景。

此外，在食品、化工、制药、能源等它都得到了广泛的应用。

随着对新型嗜热菌的分离，
嗜热微生物酶中新成分、新结构、新机制的不断发现，以及不断涌现的新技术的应用，嗜热微生物的开发和应用将出现更加广阔的前景。

1.2研究内容及技术路线
本课题试从一焦化厂的熄焦池中废水取样经预处理后进行好氧和厌氧接种在固体培养基上放置在不同高温下的烘箱培养，细菌十六小时后革兰氏染色镜检观察，筛选出不同种类的菌，并进行纯化分离出单菌，再分别以吲哚，喹啉，苯酚，吡啶为唯一碳源的无机培养基上接种分离出来的单菌，探究其对这几种杂环化合物的降解能力。

2研究内容方法
2.1实验概述
目前，许多工业废水的温度都超过了40℃，例如，大多数油田采油废水、焦化厂废水、食品加工厂废水、制药工业废水以及屠宰场废水等，而传统生化废水处理所用的嗜温菌(25～4O℃)不能直接用于处理高温废水。

为了确保生化池中微生物的活性，高效降解废水中的有害物质，废水必须进入冷却塔冷却。

但由于有些工业外排水水量大及冷却装置容易腐蚀等原因，强制冷却降温成本较高，给常规的生物处理带来较大困难。

而嗜热菌能够直接处理高温废水，可以节省冷却设备与运行费用。

同时，由于嗜热菌代谢速度快，大约是中温过程的3～10倍]，从而缩短了废水处理的水力停留时间(HRT)，提高了废水处理效率。

此外，污泥产量少，也减少了污泥处置费用。

氮杂环化合物是焦化废水有机污染物质的主要组分，占总有机组分的20-30%，含量超过200 mg/L。

多数氮杂环化合物气味恶臭且毒性大，不仅对人体健康与生态环境造成威胁，还对微生物产生抑制作用。

在焦化废水生物处理单元中，氮杂环化合物的降解率达90%以上，说明在焦化废水长时间驯化与高浓度复杂污染物的压力下，微生物很可能通过环境的选择和诱导出特异的功能降解特性。

因此，从焦化废水中分离获得功能特异的高效降解菌的可行性，为提高生物强化处理含氮杂环化合物废水的效率，达到减少环境污染目的提供了新的思路。

本实验通过从熄焦池中筛选出嗜热菌并添加吲哚，喹啉，吡啶和苯酚为唯一碳源筛选出降解此类杂环化合物的优势菌。

表一吲哚喹啉苯酚吡啶的性质和结构
名称分子式结构物化性质和毒性
吲哚C8H7N
片状白色晶体，遇光日久会变黄红色，溶于2
体积70%乙醇，溶于丙二醇及油类，几乎不溶
于石蜡油和水；吲哚浓时具有强烈的粪臭味，
扩散力强而持久；高度稀释的溶液有香味，可
以作为香料使用。

喹啉C9H7N
无色油状液体，遇光或在空气中变黄色，有特
殊气味；微溶于水，溶于乙醇、乙醚和氯仿等
有机溶剂；碱性，喹啉的芳香性很强，苯环部
分容易在5，8两位上发生亲电取代反应；属
中等毒类，对眼睛、鼻、喉和皮肤有刺激性；
LD50：460 mg/kg(大鼠经口)；540 mg/kg(兔
经皮)。

苯稠
苯酚
C6H6O
是一种具有特殊气味的无色针状晶体，有毒。

常温下微溶于水，易溶于有机溶液；当温度高
于65℃时，能跟水以任意比例互溶。

苯酚有
腐蚀性，接触后会使局部蛋白质变性，其溶液
沾到皮肤上可用酒精洗涤，苯酚暴露在空气中
呈粉红色。

吡啶
C5H5N
无色或微黄色液体，有恶臭，溶于水、醇、醚
等多数有机溶剂；吡啶及其衍生物比苯稳定，
不易发生亲电反应；属低毒类，有强烈刺激性；
能麻醉中枢神经系统。

LD50：1580 mg/kg(大
鼠经口)，11.1 mg/kg(兔经皮)；空气中最高容
许浓度5 ppm。

2.2目的和意义
从焦化厂的熄焦池中高温筛选分离出嗜热菌并探究其最适生长温度和最高生长温度以及其对吲哚，喹啉，苯酚和吡啶的降解能力。

嗜热菌能够直接处理高温废水，可以节省冷却设备与运行费用。

同时，由于嗜热菌代谢速度快，大约是中温过程的3～10倍，从而缩短了废水处理的水力停留时间(HRT)，提高了废水处理效率。

此外，污泥产量少，也减少了污泥处置费用。

2.3实验原理
熄焦池是焦化厂用于冷却焦炭，温度大约在90摄氏度左右的池子，所用的水为回用水，因此焦化废水长时间驯化与高浓度复杂污染物的压力下，微生物很可能通过环境的选择和诱导出特异的功能降解特性。

通过高温筛选选择培养可以分离出如降解吲哚等优势菌。

2.4研究内容及技术路线
本课题试从一焦化厂的熄焦池中废水取样经预处理后进行好氧和厌氧接种在固体培养基上放置在不同高温下的烘箱培养，细菌十六小时后革兰氏染色镜检观察，筛选出不同种类的菌，并进行纯化分离出单菌，再分别以吲哚，喹啉，苯酚，吡啶为唯一碳源的无机培养基上接种分离出来的单菌，探究其对这几种杂环化合物的降解能力。

2.4.1研究内容
某熄焦池中取样经预处理高温筛选出好氧和兼性厌氧菌并初步探究其最适生长温度和最高生长温度。

2.4.2技术路线
本课题试从一焦化厂的熄焦池中废水取样经预处理后进行好氧和厌氧接种在固体培养基上放置在不同高温下的烘箱培养，细菌十六小时后革兰氏染色镜检观察，筛选出不同种类的菌，并进行纯化分离出单菌，再分别以吲哚，喹啉，苯酚，吡啶为唯一碳源的无机培养基上接种分离出来的单菌，探究其对这几种杂环化合物的降解能力。

2.5实验材料与方法
2.5.1实验材料：
菌种来源：熄焦池水样
实验仪器：摇床，恒温培养箱、烘箱2个、高压灭菌锅、、超净工作台，耐高温塑料袋、培养皿，锥形瓶，移液器，500ml锥形瓶，250ml锥形瓶，接种环，酒精灯，显微镜，电子天平秤，称量纸等。

2.5.2实验试剂及配制方法
实验试剂：革兰氏染液、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、NaNO3、K2HPO4 、CaCO3KCl 、琼脂、NaCl、KNO3、K2HPO4、3H2O.MgSO4 、7H2O.FeSO4．7H2O、马铃薯
2.5.3培养基配方：
筛选放线菌）
3.1.1高氏一号培养基配方如下：
名称材料目的菌
高氏培养基
可溶性淀粉20g
NaCI 0．5g
KNO3 1g
K2HPO4．3H2O 0．5g
MgSO4．7H2O 0．5g
FeSO4．7H2O 0．01g
琼脂15～25g
水1000ml
pH 7.4～7.6
3.2.1配制步骤
1、称量和溶化
按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。

然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。

待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。

2、调pH
用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。

反之，用1mol/LHCI进行调节。

3、灭菌
将配好的培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。

4、倒平板
将灭菌的培养基放置于超净工作台冷却至500C左右，就可以倒平板了。

5、无菌检查
实验过程中做对照组，将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。

（备注：做穿刺实验时，先将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。

加塞后，将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层报纸，其外再用一根橡皮筋扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

最后进行高温灭菌，待其冷却后就可以做穿刺实验了）
3.2、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（分离酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌的常用培养基）
3.2.1马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方
马铃薯200克
葡萄糖20克
琼脂15~20克
自来水1000毫升
自然PH
3.2.2配制步骤
其做法是先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。

3.2.3其他事项
1.培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

2.PDA培养基一般不需要调pH。

对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。

如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液进行调节。

调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

3.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。

4.培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.2g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性
5、无菌检查
实验过程中做对照组，将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。

（备注：做穿刺实验时，先将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。

加塞后，将全部试管用橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层报纸，其外再用一根橡皮筋扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

最后进行高温灭菌，待其冷却后就可以做穿刺实验了）
3.3、牛肉膏蛋白胨培养基
3.3.1牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方
牛肉膏5g
蛋白胨10g
氯化钠5g
琼脂20g
蒸馏水1000mL
pH 7.0～7.2
灭菌1.05kg/cm2，22min
3.3.2配制步骤
1、称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

2、溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

3、调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

4、灭菌
将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

5、倒平板
实验步骤
器材药剂准备培养基配制调pH 灭菌倒平板和试管样品预处理（废水在60℃加热一小时）平板涂布和穿刺实验置于不同温度下的烘箱培养（温度为60℃70℃80℃）十六小时后革兰氏染色观察高氏培养基继续培养48小时观察
方案一
初筛
取熄焦废水20ml，60℃恒温水浴1h,测pH→ 移液0.1ml涂布（高氏培养基、综合YPG 培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基各5个，另外设置空白对照和阳性对照各一个）→烘箱55℃和65℃恒温（保湿）培养→观察和记录菌落表征
复筛
将初筛出来的嗜热菌分别涂布在以3-甲基吲哚为唯一碳源的培养基上（调节pH到熄焦废水的pH），烘箱55℃和65℃恒温（保湿）培养16h，观察菌落生长情况。

第二部分
（一）革兰氏染色法染色过程：
1．涂片：先用酒精灯将载玻片灭菌后，在上面滴一滴水，接着拿用酒精灯灭菌后的接种环，在酒精灯附近的无菌范围内分别调取少量菌体均匀涂在液滴处。

2．固定：涂菌面朝上，将载玻片来回通过火焰2~3次。

此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固态细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不宜过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

3．初染：滴加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色1~2min，水洗。

4．媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

5．脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以纸巾，用95 ％的酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色为止，立即用水冲净酒精。

6．复染：用番红掖复染约2min，水洗。

7．镜检：干燥后，用油镜观察。

（二）油镜观察过程：
1．将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下。

2．先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴镜油一滴，再换油镜观察。

3．转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。

此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。

4．双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。

5．观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。

油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。

若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。