EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨
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由于混合碳源是唯一的显著影响因素故最优试验包含在号试验中取其平均值作为最优试验结果所得灰树花菌丝干重为为液体培养中复杂碳源的存在对菌丝生长和多糖形成有利这与次级代谢及糖类生化原理相符
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而言， 因素 $ 显著， 因素 %、 &、 ’ 没有显著影响。 $ 的优 水平为 $# 。 故培养基的优化组成为： 马铃薯 #(") * 葡萄 麸皮 #" , +()， 酵母膏 !- " , #- ()， 磷酸二氢钾 糖 +")， 取 # , () * .， 硫酸镁取 "- ( , #) * .， 并按照磷酸二氢钾 与硫酸镁质量浓度比分别为 "- #/ * "- #/ 、 "- +/ * "- !(/ ，"- 0/ * "- !/ 和 "- (/ * "- "(/ 之一任取，水 !.。由于混合碳源是唯一的显著影响因素，故最优试 验包含在 ( , 1 号试验中， 取其平均值作为最优试验结 果， 所得灰树花菌丝干重为 !2- 3) * .。 #- 0 讨论
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加量的增加而增加； 当加入的 $%$&’ 过量时， ()*+ 用
!分析检验
可达到目的， 而 20’ ・0, & 调节到相同的 /0 时7 用量 量基本稳定，不再随 $%$&’ 的增加而变化。这说明， 比较大，所以实际测定中我们选择用 !"1 的 2%&0 来 ()*+ 定钙法测定发酵液中乳酸含量的时候，所测样 调节测定溶液的 /0 值。 品一定事先用过量 $%$&’ 中和，测定结果才可靠。否 ,- # 测定回收率实验 则， 将产生很大的误差。 ,- , 碳酸钙过量并过滤对测定结果的影响 为了进一步考察溶液中有过量的 $%$&’ 存在时 对测定结果有无影响，我们在已知浓度的乳酸对照液 中加入过量的 $%$&’ 后，对样液进行过滤，以除去过 量的 $%$&’， 然后再滴定， 实验结果见表 !。
中图分类号： 8FGH"I J 文献标识码： A 文章编号： !""H K LL#" M H""# N "# K "!"H K "G
乳酸在食品、 医药、 化学工业、 皮革、 香料等领域具 有广泛的用途。高光学纯度的聚 ; K 乳酸是生产生物 降解的包装材料的良好原料
R!S
按参考文献样品至少平行测
。乳酸分子含有不对称
因此有 ; K 、 由于人 < 原子， @ K 乳酸两种旋光异构体。 体只具有分解 ; K 乳酸的 ; K 乳酸脱氢酶， 故人体只能 代谢 ; K 乳酸，而 @ K 乳酸摄入过多会引起人体的代 谢紊乱，所以在食品和医药上 ; K 乳酸的应用越来越 广泛。 目前，乳酸基本以微生物发酵生产为主。在发酵 生产过程中，乳酸含量的检测是个关键问题。乳酸含 旋 量的测定方法主要包括酸碱滴定、 ?@8A 络合滴定、 光法、 酶电极法、 层析法、 气相色谱法和液 TP K 酶法、 相色谱法等 R H S 。 一般来说， 每种方法都有其自身的适应 范围和准确度， 此外， 还受到方法的成本及对检测速度 要求的影响。 ?@8A 定钙法是以络合反应为基础的测 定乳酸含量的方法，它依据发酵液中的乳酸与过量 <%<U# 形成乳酸钙后，用 ?@8A 标准溶液滴定乳酸钙 中所含有的钙，通过发酵液中乳酸与钙定量反应的关
表! 样品处理 样品过滤 样品不过滤 过滤对测定结果的影响 ()*+ 用量 B 89 D !?- ,5 !?- ,’ 乳酸钙 （ 89） , # 5 @ !"1 2%&0 ()*+ 用量 （ 89） !3- @5 ,,- 3! ,?- #! ’5- @,
收稿日期： #""# : "3 : !1 基金项目： 安徽省自然科学基金资助项目 ; "!"0!+"# < 作者简介： 郑志 ; !23! : < ， 男， 讲师， 在职博士研究生， 研究方向为微生物工程。
!分析检验
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!工艺技术
与葡萄糖加马铃薯对产量影响不大的结论。 文献 6 5 7 认 为液体培养中复杂碳源的存在对菌丝生长和多糖形成 有利， 这与次级代谢及糖类生化原理相符。 本文的试验 结果验证了这种解释。 与文献 6 5 7 最优培养基组成玉米 酵母粉 "- () * . 不同， 本文的试验说明， 强 淀粉 (") * .、 调混合碳源中缓释碳源和直接利用碳源的比例，对生 物量有显著影响。 #4 04 + 试验结果与文献的比较说明，针对不同的灰 树花菌株， 深层发酵的培养基不尽相同， 但可以参照现 有的文献进行选择，如果在试验或生产中出现某些不
也属正常。 对灰树花 ("#05 而言， 最佳培 同情况， #4 04 ! 试验结果表明， 养基组成为： 马铃薯 #(") * 葡萄糖 +")， 麸皮 #" , +()， 酵母膏 !- " , #- ()， 磷酸二氢钾与硫酸镁质量浓度比任 取 "- #/ * "- #/ 、 "- +/ * "- !(/ ， "- 0/ * "- !/ 和 水 !.。!. 培养基可得灰树花菌丝 "- (/ * "- "(/ 之一， !2- 3)。文献 6 + 7 的最佳培养基为 5/ 葡萄糖、 +/ 的麸 生物量干重为 !5- () * .。文献 6 5 7 皮、 !(/ 板栗壳煮汁， 在最优配方玉米淀粉 (") * .、 酵母粉 "- () * . 时菌体生 物量为 !+- 5) * .。 文献 6 # 7 在最优组合葡萄糖 #") * .、 豆 磷酸二氢钾 !- () * . 和有机物 3) * . 时， 得到 粉 +") * .、 的最大菌丝生物量为 !(- 31) * .。可见， 本文对灰树花 液体深层发酵影响因子及其水平的选择基本合理，并 在此基础上通过优化试验得到了最优培养基组成。 #4 04 # 培养基组成中混合碳源的组成对灰树花生物 量有显著影响。该结论不支持文献 6 + 7 得到的葡萄糖
系， 间接计算出乳酸含量。由于这种方法简单， 快速， 发酵培养基中加入一定量的 <%<U# 固体， <%<U# 可以 重复性好， 投入成本低， 所以该检测方法在很多生产厂 与发酵中产生的乳酸反应，生成乳酸钙，从而中和乳 家使用。有资料表明，发酵液中除乳酸外，还含有乙 酸、 苹果酸、 富马酸、 琥珀酸等有机酸 ， 这使得测定的
定三次， 根据测定结果， 对可疑数据进行取舍后， 取其 !7 H7 H 9:;< 检测方法 采用 Y%,’.*Z!Z 高压液相色谱仪进行测定，色谱 柱为美国 [’.$\ 公司的 :2.-*16’. O X8AO <!V 反相 柱，M HZ"1 G7 L， 流动相为 "7 ""Z=-& ] ; 的 9H XUG Z!= N ， 溶液， 流速 "7 V=& ] =()， 检测波长 H!")=， 进样量 H"!&， 柱温为室温， 信噪比设为 # R Z S 。发酵液的处理是取过滤 后的发酵液 G=&， 加入 G=& 的 "7 Z=-& ] ; 的 9H XUG ， 然后 过 滤 ， 取 滤 液 &=&， 稀 释 到 !""=& 的 容 量 瓶 中 ， 用 即为待测样液。乳酸和富马 "7 GZ!= 孔径的滤膜抽滤， 酸定量采用美国 X(0=% 公司的色谱纯乳酸通过外标曲 线进行。 H H7 ! 结果与分析 <%<U# 的加入量对测定结果的影响 在米根霉发酵生产乳酸的过程中，一般会预先在
!"#$ 定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨
郑 志9 姜绍通9 潘丽军 #+"""2 < ; 合肥工业大学生物与食品工程学院9 合肥
摘
要 = B’C$ 定钙法是目前测定发酵液中乳酸含量的主要方法。本文采用对照乳酸结合高效液相色谱法对该方法的
测定条件进行了研究。结果表明， 发酵液中的乳酸必须预先用过量的 &D&E+ 中和， 再用 ADEF 调节 GF 至 !#- " 以上， 以 钙黄绿素为指示剂时， 测定结果的重复性和回收率较好。 FH.& 法与 B’C$ 定钙法测定结果比较， 发现 B’C$ 定钙法测 定的乳酸含量偏大， 但可通过适当校正用于生产过程检测。 关键词 = 乳酸 I B’C$ 滴定 I 高效液相色谱法
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657 6(7 参考文献： 6!7 6#7 6+7 607 徐洁等 - 灰树花浸膏粉的生产及其化学成分分析 6 8 7 - 江 ： 西农业大学学报 9 #""" ， ## （ +） 0#1 : 0+"汪维云 - 灰树花液体深层培养及微量元素富集作用研究 6 ’ 7 - 江苏理工大学博士论文 9 !222裘娟萍等 - 灰树花深层发酵培养基的研究 6 8 7 - 微生物学 通报 9 #""" ， ： #3 （ 0） #3( : #31孙希雯等 - 灰树花深层发酵培养基及一种胞外粗多糖快 速测定方法的建立 6 8 7 - 天津轻工业学院学报 9 !2229 （ ： +） #( : #1暴增海等 - 灰树花母种培养基的筛选试验初报 6 8 7 - 中国 食用菌 9 !( ; + < = !2方维明等 - 营养因子对灰树花多糖发酵的影响 6 8 7 - 江苏 ： 农业研究， !222 ， #" （ 0） 5( : 514
R#S
酸，以维持发酵液的 19 值在 L 左右，消除较低的 19 值对米根霉发酵行为的抑制 / 这样发酵能够正常继续 进行。本实验采用已知准确浓度的分析纯乳酸工作液 Z=&，加入不同量的 <%<U# / 考查了 <%<U# 的过量与否 对测定结果的影响， 实验结果见图 !。
结果反映的是这些能和 <%<U# 反应的各种有机酸的 总量， 而不仅仅是乳酸的含量。所以， 探讨 ?@8A 定钙 法的测定条件及影响因素，以及如何实现准确快速测 定具有重要意义。本文采用对照乳酸，并结合高效液 相色谱法来对这一传统的方法进行研究，以期找出 ?@8A 定钙法测定发酵液中乳酸含量的影响因素及实 现准确测定的条件。 ! !7 ! 材料与方法 材料
发酵液采用的是米根霉 O6#7 V!W 发酵甘薯淀粉， 以 M Q9G N H XUG 为氮源， 发酵 JH6 后的发酵液。 !7 H !7 H7 ! 检测方法 ?@8A 定钙法
实验中， 通过计算知道， 中和 Z=& 的乳酸， 理论计 算需要碳酸钙 "7 !HZ0。 由图! 可知， 在 <%<U# 不过量 M 即 加入量 ^ "7 !HZ0 N 时， 滴定消耗的 ?@8A 量随 <%<U# 添
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中图分类号： 8FGH"I J 文献标识码： A 文章编号： !""H K LL#" M H""# N "# K "!"H K "G
乳酸在食品、 医药、 化学工业、 皮革、 香料等领域具 有广泛的用途。高光学纯度的聚 ; K 乳酸是生产生物 降解的包装材料的良好原料
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按参考文献样品至少平行测
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因此有 ; K 、 由于人 < 原子， @ K 乳酸两种旋光异构体。 体只具有分解 ; K 乳酸的 ; K 乳酸脱氢酶， 故人体只能 代谢 ; K 乳酸，而 @ K 乳酸摄入过多会引起人体的代 谢紊乱，所以在食品和医药上 ; K 乳酸的应用越来越 广泛。 目前，乳酸基本以微生物发酵生产为主。在发酵 生产过程中，乳酸含量的检测是个关键问题。乳酸含 旋 量的测定方法主要包括酸碱滴定、 ?@8A 络合滴定、 光法、 酶电极法、 层析法、 气相色谱法和液 TP K 酶法、 相色谱法等 R H S 。 一般来说， 每种方法都有其自身的适应 范围和准确度， 此外， 还受到方法的成本及对检测速度 要求的影响。 ?@8A 定钙法是以络合反应为基础的测 定乳酸含量的方法，它依据发酵液中的乳酸与过量 <%<U# 形成乳酸钙后，用 ?@8A 标准溶液滴定乳酸钙 中所含有的钙，通过发酵液中乳酸与钙定量反应的关
表! 样品处理 样品过滤 样品不过滤 过滤对测定结果的影响 ()*+ 用量 B 89 D !?- ,5 !?- ,’ 乳酸钙 （ 89） , # 5 @ !"1 2%&0 ()*+ 用量 （ 89） !3- @5 ,,- 3! ,?- #! ’5- @,
收稿日期： #""# : "3 : !1 基金项目： 安徽省自然科学基金资助项目 ; "!"0!+"# < 作者简介： 郑志 ; !23! : < ， 男， 讲师， 在职博士研究生， 研究方向为微生物工程。
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!工艺技术
与葡萄糖加马铃薯对产量影响不大的结论。 文献 6 5 7 认 为液体培养中复杂碳源的存在对菌丝生长和多糖形成 有利， 这与次级代谢及糖类生化原理相符。 本文的试验 结果验证了这种解释。 与文献 6 5 7 最优培养基组成玉米 酵母粉 "- () * . 不同， 本文的试验说明， 强 淀粉 (") * .、 调混合碳源中缓释碳源和直接利用碳源的比例，对生 物量有显著影响。 #4 04 + 试验结果与文献的比较说明，针对不同的灰 树花菌株， 深层发酵的培养基不尽相同， 但可以参照现 有的文献进行选择，如果在试验或生产中出现某些不
也属正常。 对灰树花 ("#05 而言， 最佳培 同情况， #4 04 ! 试验结果表明， 养基组成为： 马铃薯 #(") * 葡萄糖 +")， 麸皮 #" , +()， 酵母膏 !- " , #- ()， 磷酸二氢钾与硫酸镁质量浓度比任 取 "- #/ * "- #/ 、 "- +/ * "- !(/ ， "- 0/ * "- !/ 和 水 !.。!. 培养基可得灰树花菌丝 "- (/ * "- "(/ 之一， !2- 3)。文献 6 + 7 的最佳培养基为 5/ 葡萄糖、 +/ 的麸 生物量干重为 !5- () * .。文献 6 5 7 皮、 !(/ 板栗壳煮汁， 在最优配方玉米淀粉 (") * .、 酵母粉 "- () * . 时菌体生 物量为 !+- 5) * .。 文献 6 # 7 在最优组合葡萄糖 #") * .、 豆 磷酸二氢钾 !- () * . 和有机物 3) * . 时， 得到 粉 +") * .、 的最大菌丝生物量为 !(- 31) * .。可见， 本文对灰树花 液体深层发酵影响因子及其水平的选择基本合理，并 在此基础上通过优化试验得到了最优培养基组成。 #4 04 # 培养基组成中混合碳源的组成对灰树花生物 量有显著影响。该结论不支持文献 6 + 7 得到的葡萄糖
系， 间接计算出乳酸含量。由于这种方法简单， 快速， 发酵培养基中加入一定量的 <%<U# 固体， <%<U# 可以 重复性好， 投入成本低， 所以该检测方法在很多生产厂 与发酵中产生的乳酸反应，生成乳酸钙，从而中和乳 家使用。有资料表明，发酵液中除乳酸外，还含有乙 酸、 苹果酸、 富马酸、 琥珀酸等有机酸 ， 这使得测定的
定三次， 根据测定结果， 对可疑数据进行取舍后， 取其 !7 H7 H 9:;< 检测方法 采用 Y%,’.*Z!Z 高压液相色谱仪进行测定，色谱 柱为美国 [’.$\ 公司的 :2.-*16’. O X8AO <!V 反相 柱，M HZ"1 G7 L， 流动相为 "7 ""Z=-& ] ; 的 9H XUG Z!= N ， 溶液， 流速 "7 V=& ] =()， 检测波长 H!")=， 进样量 H"!&， 柱温为室温， 信噪比设为 # R Z S 。发酵液的处理是取过滤 后的发酵液 G=&， 加入 G=& 的 "7 Z=-& ] ; 的 9H XUG ， 然后 过 滤 ， 取 滤 液 &=&， 稀 释 到 !""=& 的 容 量 瓶 中 ， 用 即为待测样液。乳酸和富马 "7 GZ!= 孔径的滤膜抽滤， 酸定量采用美国 X(0=% 公司的色谱纯乳酸通过外标曲 线进行。 H H7 ! 结果与分析 <%<U# 的加入量对测定结果的影响 在米根霉发酵生产乳酸的过程中，一般会预先在
!"#$ 定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨
郑 志9 姜绍通9 潘丽军 #+"""2 < ; 合肥工业大学生物与食品工程学院9 合肥
摘
要 = B’C$ 定钙法是目前测定发酵液中乳酸含量的主要方法。本文采用对照乳酸结合高效液相色谱法对该方法的
测定条件进行了研究。结果表明， 发酵液中的乳酸必须预先用过量的 &D&E+ 中和， 再用 ADEF 调节 GF 至 !#- " 以上， 以 钙黄绿素为指示剂时， 测定结果的重复性和回收率较好。 FH.& 法与 B’C$ 定钙法测定结果比较， 发现 B’C$ 定钙法测 定的乳酸含量偏大， 但可通过适当校正用于生产过程检测。 关键词 = 乳酸 I B’C$ 滴定 I 高效液相色谱法
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657 6(7 参考文献： 6!7 6#7 6+7 607 徐洁等 - 灰树花浸膏粉的生产及其化学成分分析 6 8 7 - 江 ： 西农业大学学报 9 #""" ， ## （ +） 0#1 : 0+"汪维云 - 灰树花液体深层培养及微量元素富集作用研究 6 ’ 7 - 江苏理工大学博士论文 9 !222裘娟萍等 - 灰树花深层发酵培养基的研究 6 8 7 - 微生物学 通报 9 #""" ， ： #3 （ 0） #3( : #31孙希雯等 - 灰树花深层发酵培养基及一种胞外粗多糖快 速测定方法的建立 6 8 7 - 天津轻工业学院学报 9 !2229 （ ： +） #( : #1暴增海等 - 灰树花母种培养基的筛选试验初报 6 8 7 - 中国 食用菌 9 !( ; + < = !2方维明等 - 营养因子对灰树花多糖发酵的影响 6 8 7 - 江苏 ： 农业研究， !222 ， #" （ 0） 5( : 514
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酸，以维持发酵液的 19 值在 L 左右，消除较低的 19 值对米根霉发酵行为的抑制 / 这样发酵能够正常继续 进行。本实验采用已知准确浓度的分析纯乳酸工作液 Z=&，加入不同量的 <%<U# / 考查了 <%<U# 的过量与否 对测定结果的影响， 实验结果见图 !。
结果反映的是这些能和 <%<U# 反应的各种有机酸的 总量， 而不仅仅是乳酸的含量。所以， 探讨 ?@8A 定钙 法的测定条件及影响因素，以及如何实现准确快速测 定具有重要意义。本文采用对照乳酸，并结合高效液 相色谱法来对这一传统的方法进行研究，以期找出 ?@8A 定钙法测定发酵液中乳酸含量的影响因素及实 现准确测定的条件。 ! !7 ! 材料与方法 材料
发酵液采用的是米根霉 O6#7 V!W 发酵甘薯淀粉， 以 M Q9G N H XUG 为氮源， 发酵 JH6 后的发酵液。 !7 H !7 H7 ! 检测方法 ?@8A 定钙法
实验中， 通过计算知道， 中和 Z=& 的乳酸， 理论计 算需要碳酸钙 "7 !HZ0。 由图! 可知， 在 <%<U# 不过量 M 即 加入量 ^ "7 !HZ0 N 时， 滴定消耗的 ?@8A 量随 <%<U# 添